फेज प्रदर्शित लाइब्रेरी से पेप्टाइड्स mesenchymal कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति न्यूनाधिक और Unicortical अस्थि दोष में अस्थिजनन शक्ति

Summary

एक फेज प्रदर्शन पुस्तकालय के लिए पेप्टाइड दृश्यों लक्ष्य हड्डी है कि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. उद्देश्य mesenchymal सेल भेदभाव पर इन पेप्टाइड्स के प्रभाव की जांच और हड्डी पुनर्जनन पर उनके प्रभाव को निर्धारित किया गया था.

Abstract

दो उपन्यास सिंथेटिक पेप्टाइड्स हड्डी गठन में तेजी लाने और एक मैट्रिक्स कोलेजन का उपयोग कर दिया जा सकता है है. इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए एक unicortical दोष मॉडल में हड्डी की मरम्मत पर प्रभाव की जांच करने के लिए गया था. Mesenchymal कोशिकाओं के उपचार alkaline फॉस्फेट गतिविधि में वृद्धि का उत्पादन किया, कोशिकाओं द्वारा गुत्थी गठन दिखाया है, और runx2, osterix, हड्डी sialoprotein, और osteocalcin के लिए जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई. कोलेजन स्पंज अस्थि दोष के पेप्टाइड पदोन्नत मरम्मत से लथपथ, जबकि कम प्रभावी नियंत्रण था. इस अध्ययन से परिणाम दिखा दिया है कि इन विट्रो में पेप्टाइड के साथ इलाज mesenchymal कोशिकाओं अस्थिजनन की दिशा में अंतर है, और है कि vivo में दिया पेप्टाइड्स एक कोलेजन स्पंज का उपयोग unicortical दोषों की मरम्मत को बढ़ावा देने के.

Protocol

1. Vivo में फेज पृथक Biopanning लक्ष्य है कि लंबे हड्डी

फेज डीएनए अनुक्रम और एक इसी अनुक्रम के साथ पेप्टाइड संश्लेषित थे. पेप्टाइड्स Gly-Gly Gly सेवा - lysine linker (linker जोड़े फ्लोरोसेंट chromophores कि ट्रैक / पेप्टाइड्स का पता लगाने में मदद करने के लिए की जरूरत है) के साथ संश्लेषित थे.

1. एक 10 सप्ताह पुरानी माउस / Balb ग anesthetized गया था, दिल अवगत कराया गया था.
2. पीएचडी 12-फेज प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय किट (न्यू इंग्लैंड Biolabs, बेवर्ली, एमए) vivo biopanning, 10 एक्स 1010 pfu में के लिए इस्तेमाल किया गया था, और दिल में इंजेक्ट किया .
3. लगभग 5 मिनट के बाद, माउस euthanized किया गया था. femurs उजागर थे और dissected, femurs के छोर से काट रहे थे, और अस्थि मज्जा हटा दिया गया था.
4. बाईं जांध की हड्डी के अंदर और बाहर पीबीएस के साथ 10 बार rinsed थे, और जांध की हड्डी ER2537 बैक्टीरिया को जोड़ा गया है (गैर eluted फेज के रूप में भेजा, तो चरण 6 पर जाएँ).
5. सही फीमर के intramedullary नहर 2% एक सिरिंज में सूखे मलाई निकाला दूध के साथ एक 21 गेज सुई के साथ दस बार rinsed गैर बाध्य फेज हटायें. एचसीएल ग्लाइसिन बफर 2.2 पीएच, 1M Tris साथ neutralized के साथ intramedullary नहर से बन्धे फेज eluted ER2537 बैक्टीरिया को जोड़ा, और 4.5 घंटे के लिए सुसंस्कृत फेज (eluted के रूप में संदर्भित) बढ़ाना.
6. जीवाणु केन्द्रापसारक अवसादन द्वारा 4 में 10 डिग्री सेल्सियस, और फेज मिनट रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर खूंटी / NaCl समाधान के अलावा से उपजी के लिए हटा दिया गया. फेज centrifugation द्वारा एकत्र किया गया था और निलंबित कर दिया और दो बार 1 / 6 / खूंटी NaCl की मात्रा के अलावा द्वारा उपजी. अंतिम गोली टीबीएस में 0.02% NaN3 के साथ resuspended था.
7. दोनों eluted और गैर eluted फेज से परिलक्षित eluates अलग चूहों में इंजेक्ट किया गया, और फेज इसके बाद के संस्करण के रूप में पृथक किया गया. केवल बाईं फीमर माउस है कि गैर eluted फेज के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था, और जांध की हड्डी सीधे बैक्टीरिया में रखा है (ऊपर चरण 4 देखें) से हटा दिया गया था. eluted फेज माउस केवल सही जांध की हड्डी और बैक्टीरिया को जोड़ने से पहले एचसीएल ग्लाइसिन बफर द्वारा जारी फेज (5 ऊपर चरण देखें) से पृथक किया गया.
8. यह vivo biopanning प्रक्रिया में प्राइमर (फेज प्रदर्शन किट के साथ प्रदान की)-98 का उपयोग डीएनए अनुक्रमण पहले तीन बार दोहराया गया था.
9. जमा फेज बैक्टीरियल संस्कृतियों में परिलक्षित थे, शुद्ध, quantitated और फिर एक चौथा माउस में इंजेक्शन थे. अनुक्रमण दोहराया था.
10. हड्डी और मज्जा पेप्टाइड विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए, फेज गुर्दे से eluted और जिगर ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया. सभी चार राउंड में फेज की मामूली राशि इन अंगों (कम से कम 10%) में स्थित था.
11. पेप्टाइड्स Gly-Gly Gly सेवा - Lys एक दृश्य के साथ संश्लेषित किया गया, के साथ और सेल और ऊतक धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा बायोटिन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह vivo में काम में लिए बिना.

2. Osteogenic सेल भेदभाव प्रयोगों के लिए Mesenchymal सेल संस्कृति

1. एक क्लोन माउस pluripotential stroma बोन मैरो (D1) सेल हमारे ^एक प्रयोगशाला में अलग लाइन के लिए इन विट्रो प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था. कोशिकाओं Dulbecco संशोधित आवश्यक मध्यम, DMEM, (Gibco बिल्ली # 11885-084) कम ग्लूकोज के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय (Gibco # बिल्ली 16000-044) सीरम, मिली लीटर प्रति सोडियम ascorbate के पचास मिलीग्राम (में सुसंस्कृत थे सिग्मा बिल्ली # A7631 ), और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी और 100mg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (Gibco बिल्ली # 15140-122).
2. संस्कृतियों 37 पर बनाए रखा गया ° सी 5% सीओ ₂ पानी तख्ताबंदीवाला इन्क्यूबेटरों और उप - सुसंस्कृत के humidified माहौल में जब तक कोशिकाओं मिला हुआ लगभग 90% थे.
3. सेल trypsinized थे, गोली के लिए centrifuged, गिना, और 5x10 ³ कोशिकाओं / टिशू कल्चर में ² सेमी plasticware इलाज की एकाग्रता पर वरीयता प्राप्त.

3. संवर्धित कोशिकाओं और ऊतकों के लिए पेप्टाइड धुंधला

1. D1 या मज्जा की कोशिकाओं fibronectin या जिलेटिन लेपित कक्ष पर चढ़ाया गया अच्छी तरह से स्लाइड DMEM और 10% 24 घंटे के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त है.
2. कक्ष पीबीएस के साथ धोया गया. कक्ष / ऊतक 4% paraformaldehyde के साथ 30 मिनट के लिए तय किए गए थे
3. अतिरिक्त एल्डिहाइड 0.5 एम Glycine (7.5 पीएच) का उपयोग कर 10 मिनट के लिए अवरुद्ध किया गया.
4. अंतर्जात avidin और बायोटिन रिसेप्टर्स कोशिका की सतह पर 1 घंटे के लिए 5% BSA + Avidin अवरुद्ध समाधान के अलावा द्वारा अवरोधित किया गया था, Pbs के साथ एक बार 5 मिनट, तो 1 घंटे के लिए 5% BSA + बायोटिन अवरुद्ध समाधान के साथ अवरुद्ध लिए rinsed.
5. फिर 100 सुक्ष्ममापी L7 biotinylated और R1 पेप्टाइड्स 30 मिनट के लिए कुओं को जोड़ा गया.
6. कक्ष पीबीएस के साथ प्रत्येक और एलेक्सा मैदा streptavidin के 1:1000 कमजोर पड़ने जोड़ा गया था और 30 मिनट के लिए अंधेरे में incubated 5 मिनट के लिए तीन बार धोया गया.
7. कक्ष और धोया गया coverslips vectashield बढ़ते मीडिया के साथ मुहिम शुरू और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत जांच की.

4. Alkaline फॉस्फेट गतिविधि परख

1. Alkaline फॉस्फेट गolorimetric परख एक alkaline फॉस्फेट (BioRad) किट के रूप में निर्माता द्वारा सिफारिश का उपयोग monolayers पर प्रदर्शन किया गया था.
2. D1 कोशिकाओं एक 5 x 10 ³ कोशिकाओं / ² सेमी 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों पर घनत्व पर चढ़ाया गया और R1 पेप्टाइड के साथ इलाज किया, ALP गतिविधि 4 दिन, 8, 12, 16 और 20 में मात्रा निर्धारित किया गया था.
3. सेल lysates तैयार करने के लिए, सेल परतों PBS बफर के साथ तीन बार धो रहे थे और फिर पीबीएस में scraped sonication और centrifugation सेलुलर मलबे को हटाने के द्वारा पीछा किया.
4. Lysate (100 μL) के बराबर मात्रा तो हौसले से तैयार वर्णमिति सब्सट्रेट के 100 μL पैरा - nitrophenyl फॉस्फेट के साथ मिलाया गया था, और 37 में incubated ° सी 30 मिनट के लिए.
5. enzymatic प्रतिक्रिया 0.2 एन NaOH समाधान के 100 μL जोड़कर बंद कर दिया गया था. ALP गतिविधि एलिसा रीडर (जैव रेड) का उपयोग कर 405 एनएम पर मापा गया था.
6. सेल lysates प्रोटीन एकाग्रता एक BioRad प्रोटीन परख किट के साथ मापा गया था, और एपी गतिविधि तो nmol / / मिनट मिलीग्राम प्रोटीन का उत्पादन पैरा nitrophenol के रूप में व्यक्त की गई थी.
7. ALP गतिविधि निर्माता विनिर्देशों (सिग्मा इंक) के अनुसार गणना की गई.
8. ALP गतिविधि की इकाइयों सेल lysate के बीसीए परख (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल) के साथ कुल प्रोटीन सामग्री के मिलीग्राम के लिए सामान्यीकृत थे.

5. Mesenchymal सेल L7 और R1 का उपयोग भेदभाव

1. Subconfluent mesenchymal कोशिकाओं (D1) लगभग 90 confluency% हो गया और L7 5nm और R1 पेप्टाइड के साथ इलाज किया.
2. कक्ष 0.5, 2, 6, 24 और 48 बजे काटा गया है, और शाही सेना Qiagen RNeasy किट निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर का उपयोग कर तैयार किया गया था.
3. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रियाओं (आरटी) (37 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) annealed थे और पहली भूग्रस्त सीडीएनए (42 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट) संश्लेषण और गर्मी निष्क्रियता (95 ° 5 मिनट के लिए सी) द्वारा पीछा किया. परिणामस्वरूप सीडीएनए संग्रहीत किया गया है जमे हुए (-70 डिग्री सेल्सियस) जब तक वास्तविक समय पीसीआर assayed द्वारा.
4. वास्तविक समय पीसीआर QuantiTect SYBR ग्रीन पीसीआर किट (Qiagen) का उपयोग किया गया था. प्रतिक्रियाओं SYBR ग्रीन किट मास्टर मिश्रण के 25 μL और आगे और हड्डी Runx2 जैसे, Osterix, Osteocalcin, अस्थि sialoprotein, और जैसे ख catenin Wnt मार्ग जीन के लिए विशिष्ट जीन की रिवर्स प्राइमरों (300 nmol / एल) के साथ प्रदर्शन किया गया, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 और OPG और RANKL (देखें तालिका 1).
5. सीडीएनए का नमूना के 3 μL अंतिम प्रतिक्रिया आरटी प्रतिक्रिया से undiluted मिश्रण को जोड़ा गया है. 96 अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्रारूप छह डीएनए प्लाज्मिड मानकों के दो प्रतियों में 10 गुना dilutions शामिल हैं. थाली के कुओं ऑप्टिकल चिपकने वाला कवर (BioRad) के साथ बंद थे और कम गति (300 ग्राम, 5 मिनट) पर centrifuged मिश्रण पूरा करने के लिए सुनिश्चित करें.
6. प्रत्येक नमूना कम से कम iCycler साधन (BioRad प्रयोगशालाओं, हरक्यूलिस, सीए) के साथ दो प्रतियों में विश्लेषण किया गया था.
7. पीसीआर प्रोटोकॉल AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ शामिल सक्रियण 94 विकृतीकरण के 40 चक्र द्वारा पीछा इस्तेमाल ° C 30 सेकंड के लिए, 72 ° C पर संबंधित annealing 30 सेकंड है, और विस्तार के लिए 30 सेकंड के लिए तापमान. प्रत्येक नमूना के लिए पीसीआर दहलीज चक्र संख्या (सीटी) के बिंदु जहां प्रतिदीप्ति सीमा पार पर गणना की थी. सीमा रैखिक लॉगरिदमिक चरण 10 से 20 औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ऊपर मानक विचलन (एसडीएस) पर प्रतिदीप्ति घटता के साथ तय किया गया था. मानक वक्र समीकरणों औसत सीटी की कुल शाही सेना पेश करने के लिए सीडीएनए रिश्तेदार के log10 बनाम प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा गणना की गई. लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति हड्डी विशिष्ट जीन के लिए 18s सामान्यीकृत था और बी actin Wnt मार्ग जीन के लिए इस्तेमाल किया गया था.

6 Gelfoam समग्र के vivo तैयारी में है .

1. सड़न रोकनेवाला दिनचर्या का प्रयोग, gelfoam सिलेंडरों (Pharmacia और Upjohn बिल्ली 09-0353-01 #), लंबाई में 8 मिमी से व्यास में 3 मिमी, आत्म डिजाइन साधन का उपयोग कर बनाए गए थे.
2. चौबीस घंटे की सर्जरी से पहले, gelfoam सिलेंडरों थे सोख - लोड L7 या R1 (पीबीएस में 20 सुक्ष्ममापी) पेप्टाइड पेप्टाइड या बिना PBS बफर के साथ. gelfoam सिलेंडरों बाँझ 12 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन को स्थानांतरित कर दिया गया और -4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संग्रहित
3. सर्जरी के समय, संस्कृति बर्तन में gelfoam समग्र रेफ्रिजरेटर के बाहर चले गए थे और सर्जरी जब तक बर्फ पर डाल दिया.

7. अस्थि दोष

1. सभी पशु प्रक्रियाओं पशु की देखभाल और स्वास्थ्य प्रणाली के उपयोग समिति वर्जीनिया विश्वविद्यालय में पहले प्रदर्शन किया जा रहा द्वारा अनुमोदित किया गया. दस नौ महीने की उम्र में वयस्क syngeneic पुरुष फिशर 344 चूहों (350-400 छ) ketamine (ग्राम शरीर के वजन के प्रति 50 ग्राम) और xylazine (ग्राम प्रति शरीर के वजन 5 ग्राम) के एक मिश्रण के साथ anesthetized intraperitoneally थे.
2. एक द्विपक्षीय शल्य दृष्टिकोण टिबिअ के anteromedial पहलू को बनाया गया था. इस उम्र में या बड़े चूहे तुच्छ पार के अनुभागीय क्षेत्र में बढ़ जाती है, cortical हड्डी क्षेत्र, हड्डी द्रव्यमान, अस्थि घनत्व, और anteromedia के axial लंबाई बताते हैंटिबिअ के एल पहलू है. एक बड़े, आयताकार unicortical दोष है जो लंबे समय का उपयोग कर एक साँस गड़गड़ाहट (हॉल उच्च गति ड्रिल, Zimmer) 8 मिमी से 3 मिमी चौड़े मापा खारा सिंचाई के तहत बनाया गया था.
3. अस्थि दोष gelfoam के साथ इलाज किया गया था या तो पेप्टाइड्स के साथ या बिना. सभी प्रत्यारोपित scaffolds, 1.5 मिमी गहराई से 8 मिमी लंबाई से 3 मिमी चौड़ाई को मापने, कोमल दोहन द्वारा डाला गया. कोई बाहरी या आंतरिक अंग निर्धारण उपकरणों postoperatively के लिए इस्तेमाल किया गया, और प्रतिबंध के बिना ambulate की अनुमति दी पशुओं को तुरंत सर्जरी के बाद.

8. प्रोटोकॉल और Morphometry

अस्थि पुनर्जनन सकल आकारिकी और डिजिटल छवियों लिया के द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

1. चूहे और euthanized थे tibias 3 पर एकत्र किए गए थे, 5, और 12 सप्ताह नई चोट के जवाब में उत्पन्न हड्डी की राशि मात्रा ठहराना करने के लिए.
2. अस्थि दोष सावधानी से जाँच करने के बाद, काटा टिबिअ 10% में तय किया गया तटस्थ formalin buffered, RDO तेजी decalcifier में 72 घंटे के लिए decalcified, तो नियमित संसाधित और आयल में एम्बेडेड है, और sectioned longitudinally.
3. अस्थि पुनर्जनन सकल और प्रकाश सूक्ष्म परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
4. दस पशुओं के प्रत्येक हालत (यानी, खाली दोष, gelfoam अकेले, और gelfoam plus R1 पेप्टाइड) के लिए इस्तेमाल किया गया. 8mm unicortical दोष ~ 40 ऊतक वर्गों, जिनमें से प्रत्येक 8 सुक्ष्ममापी मोटी थी भर में प्रतिनिधित्व किया था. उन 40 वर्गों में से, हम 6 वर्गों के न्यूनतम इस्तेमाल के लिए नई हड्डी की राशि यों.
5. सभी ऊतक वर्गों hematoxylin / eosin (एच एंड ई) है, जो osteoid मैट्रिक्स लेबल के साथ दाग रहे थे.
6. सभी स्लाइड्स माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया.

9. अस्थि मरम्मत

अवलोकन

अस्थि मरम्मत स्पष्ट रूप से musculoskeletal ऊतक पुनर्जनन के क्षेत्र में एक विचार की एक बहुत ही महत्वपूर्ण क्षेत्र है. पेप्टाइड्स कि लक्ष्य हड्डी हड्डी रोग शल्य चिकित्सा के अभ्यास में protheses कि साल नहीं तो दशकों के लिए निबाह किया जा सकता है के उपयोग में विशेष रूप से महत्वपूर्ण उपयोगिता, हो सकता है. हड्डी रेखा कारकों के biomimetic गुणों ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक तकनीकी कदम आगे, के रूप में अच्छी तरह के रूप में हड्डी के कृत्रिम सर्जरी के लिए बना सकता है. सिंथेटिक या प्राकृतिक पॉलिमर में हड्डी लक्ष्यीकरण कारकों का समावेश सेल पालन की विशिष्टता सहायता, जिससे ऊतकों कि मरम्मत और उत्थान के दौर से गुजर रहे हैं के भीतर अंतर्जात कोशिकाओं सफाई सकता है. एक अतिरिक्त लक्ष्य अगर हमारी अद्वितीय vivo में एक फेज प्रदर्शन पुस्तकालय के biopanning द्वारा पहचान पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण हड्डी हड्डी और अस्थि मज्जा से अलग कक्षों के लिए बाध्य होगा की स्थापना, और vivo में इन विट्रो और हड्डी पुनर्जनन में अस्थिजनन मिलाना संभावित था.

हमारे प्रयोगों में, हम प्राकृतिक और सिंथेटिक बहुलक matrices और हड्डी पुनर्जनन ऊतक विज्ञान, जैव रसायन, जीन अभिव्यक्ति, सूक्ष्म सीटी और क्रम में biomechanics के द्वारा जांच की हड्डी पुनर्जनन पर पेप्टाइड गतिविधि का ब्यौरा स्पष्ट का उपयोग चूहों में ऊरु दोष में पेप्टाइड्स दिया. इस दृष्टिकोण के आगे विकास और biologically सक्रिय यौगिकों कि लक्ष्य हड्डी की खोज और विकास के लिए नेतृत्व और मरम्मत तंत्र है कि अच्छी तरह से सेलुलर और आणविक स्तर पर जैविक विशेषता के माध्यम से शक्ति प्रदान कर सकते हैं.

धुंधला हो जाना

पेप्टाइड्स बायोटिन लेबल के साथ संश्लेषित किया गया क्रम में mesenchymal कोशिकाओं बंधन और स्थानीयकरण निर्धारित है. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) लेबल avidin microscopically इन विट्रो में विकसित कोशिकाओं पर पेप्टाइड्स के बंधन स्थानीयकरण इस्तेमाल किया गया था. पेप्टाइड्स संस्कृति में mesenchymal कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और इन विट्रो में माउस रिब ऊतक वर्गों (चित्रा 1) में अस्थि मज्जा करने के लिए बाध्य.

वॉन Kossa धुंधला

एक mesenchymal सेल (D1) अस्थि मज्जा से क्लोन किया गया था और कोशिकाओं पर इन विट्रो में पेप्टाइड्स के osteogenic प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया. कोशिकाओं L7 पेप्टाइड्स और R1 के साथ इलाज किया गया सेल आकारिकी और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निर्धारण. 4 दिन, कोशिकाओं कुल के लिए शुरू किया था, और समुच्चय पिंड, एक सेल संस्कृति में अस्थि कोशिकाओं (चित्रा 2) के लिए इसी तरह की व्यवहार पैटर्न के रूप में समय के साथ बढ़े.

पेप्टाइड L7 के अलावा या वॉन Kossa साथ संस्कृतियों की कोशिकाओं बढ़ाया धुंधला हो जाना करने के लिए R1. कोशिकाओं तो संस्कृति में 16 दिनों के लिए L7 पेप्टाइड या R1 के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. यह निर्धारित किया गया था कि 5 एनएम पेप्टाइड इन विट्रो में सबसे प्रभावी था. संस्कृतियों है कि पेप्टाइड के साथ इलाज किया गया में alkaline फॉस्फेट गतिविधि के बीच 2 और 3.5 गुना से वृद्धि हुई है. गुना वृद्धि पेप्टाइड और संस्कृति में उपचार के समय की एकाग्रता पर निर्भर करता था.

वास्तविक समय पीसीआर

L7 के साथ इलाज किया कोशिकाओं और R1 पेप्टाइड्स रियल - टाइम पी का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गयादो ज्ञात हड्डी सेल प्रतिलेखन कारकों (Osterix और Runx2) और तीन अस्थि मैट्रिक्स प्रोटीन (हड्डी sialoprotein, osteocalcin और कोलैजेन प्रकार मैं) के लिए जीन की अभिव्यक्ति के लिए सीआर. R1 के साथ उपचार Osterix और Runx2 जीन अभिव्यक्ति में बढ़ जाती है दिखाया. कोलेजन टाइप 1 जीन की अभिव्यक्ति अपरिवर्तित रहे. L7 के साथ उपचार बसपा और osteocalcin जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मैं कोलेजन जीन प्रकार की अभिव्यक्ति से पता चला है. यह दर्शाता है कि दोनों पेप्टाइड्स जीन है कि शुरुआत और mesenchymal सेल संस्कृतियों में अस्थिजनन की प्रगति से संबंधित हैं पर एक प्रभाव है.

पेप्टाइड्स R1 और L7 के साथ इन विट्रो सेल संस्कृतियों में के उपचार के एक anabolic प्रभाव हड्डी गठन mesenchymal कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए संबंधित से पता चला है. Osteoprotegerin की RANKL के अनुपात में वृद्धि हुई हड्डी resorbing कोशिकाओं है कि osteoclasts रूप में जाना जाता है की भर्ती में कमी को इंगित करता है. पेप्टाइड्स के साथ कोशिकाओं के उपचार भी है कि हड्डी गठन के साथ जुड़े रहे हैं और कारक है कि अस्थिजनन बाधित घटता जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए होता है.

प्रोटोकॉल

हड्डी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हम μLtraviolet जिससे autofluorescence उत्पादन प्रकाश हड्डी की स्लाइस उजागर. यह ² quantitation के प्रयोजन के लिए हड्डी और गैर हड्डी ऊतकों के बीच अधिक से अधिक विपरीत प्रदान करता है. वर्गों Nikon डिजिटल इमेजिंग सिस्टम के द्वारा एक ही बढ़ाई (x10 उद्देश्य) में दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और यूवी प्रकाश (चित्रा 3) एक Nikon और पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर फोटो खिंचवाने थे. परिणामस्वरूप डिजिटल छवियों Metavue इमेजिंग सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण) के साथ विश्लेषण किया गया. हम ब्याज की एक निश्चित, आयताकार क्षेत्र (आरओआई) है कि 8 मिमी unicortical दोष निहित चुना. चोट साइट हमेशा से मैन्युअल रूप से प्रत्येक छवि पर सही स्थिति में बॉक्स रखकर इस रॉय अंदर प्रतिनिधित्व था. एच एंड ई पॉजिटिव पिक्सल आंशिक रूप से जादू की छड़ी उपकरण एक रंग सहिष्णुता के लिए सेट का उपयोग कर स्वचालित किया गया. यह सहिष्णुता हरे रंग की एक सीमा है कि एच एंड ई - दाग वर्गों में हड्डीवाला ऊतक के histological उपस्थिति के साथ ठीक corresponded के साथ प्रकाश डाला पिक्सल के परिणामस्वरूप सेटिंग. एच एंड प्रत्येक अनुभाग के लिए ई सकारात्मक पिक्सल की कुल संख्या दर्ज की गई थी. अलग - अलग वर्गों से पिक्सेल गिनती के लिए प्रत्येक tibial नमूना औसतन थे और भीतर और उपचार समूहों के बीच मतभेद इन औसत के आधार पर गणना की गई. सभी नमूनों के लिए क्षेत्रों में तो नए cortical हड्डी की राशि (चित्रा 4) पर आधारित तुलना में थे .

वर्गों में हड्डी की उपस्थिति अकेले gelfoam तुलना द्वारा gelfoam + पेप्टाइड के साथ इलाज दोष में हड्डी की मरम्मत निर्धारित मात्रा निर्धारित किया गया था. दोष है कि gelfoam + R1 पेप्टाइड के साथ भर गए थे cortical मरम्मत के एक 10 के साथ सबसे बड़ी राशि, 7 और 2 गुना वृद्धि 3, 5, 12 सप्ताह क्रमशः दिखाया. gelfoam में cortical हड्डी की मरम्मत में मतभेद + पेप्टाइड के साथ तुलना में अकेले gelfoam 3 और 5 हफ्तों में सबसे अधिक ध्यान देने योग्य थे प्रदर्शन है कि पेप्टाइड cortical हड्डी पुनर्जनन (चित्रा 5) को बढ़ावा देता है.

10. Osteogenic पेप्टाइड्स के Anabolic प्रभाव

अनुपात / OPG RANKL RANKL / OPG अनुपात है, जो पता चलता है कि पेप्टाइड्स अस्थिकोरक पर सीधा प्रभाव है और हड्डी resorption विनियमित कर सकते हैं की तुलना में अधिक है.

सिंथेटिक पेप्टाइड्स तैयारी की गति, आणविक स्थिरता, लंबे समय के शैल्फ जीवन और संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों जैसे बड़े अणुओं से अधिक लाभ हो सकता है. महत्वपूर्ण प्रगति के प्रयास में किया गया है हड्डी और नियंत्रित करने साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों द्वारा हानि उत्थान मिलाना. ये osteotropic पेप्टाइड्स मौजूदा चिकित्सा कि अस्थि उपचय और हड्डी पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने के लिए आकर्षक विकल्प की पेशकश कर सकते हैं.

चित्रा 1 मज्जा और इन विट्रो में माउस रिब ऊतक अनुभाग में हड्डी के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड.

चित्रा 2 Mesenchymal कोशिकाओं (D1) पेप्टाइड उपचार के बाद पिंड के रूप में है.

चित्रा 3 हड्डी osteogenic पेप्टाइड्स, L7 और R1 का उपयोग कर की मरम्मत की प्रोटोकॉल.

चित्रा 4 अस्थि वर्गों यूवी प्रकाश है जो autofluorescence का कारण बनता है के तहत एच एंड ई के साथ दाग है. यह quantitation प्रयोजनों के लिए हड्डी और गैर हड्डी ऊतकों के बीच अधिक से अधिक विपरीत प्रदान करता है.

चित्रा 5 ऊतक विज्ञान वर्गों में हड्डी के quantitation पता चला cortical मरम्मत की सबसे बड़ी राशि के साथ 5 सप्ताह में हुई थी.एक बदलाव का 10 गुना, 7 और 2 गुना 3 पर और 5 सप्ताह के प्रदर्शन है कि पेप्टाइड cortical हड्डी पुनर्जनन को बढ़ावा देता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S