Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Summary

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector geheugen T-lymfocyten. Hier laten we zien hoe actief DTH induceren in Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Abstract

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T-lymfocyten die de plaats van de injectie van een antigen waartegen het immuunsysteem is gevuld te infiltreren. De ontstekingsreactie wordt gekenmerkt door roodheid en zwelling van de site van antigene uitdaging. Het is een handig model om vast te stellen de in vivo werkzaamheid van immunosuppressiva. Cutane DTH kan worden geïnduceerd door adoptieve overdracht van antigeen-specifieke T-lymfocyten of door actieve immunisatie met een antigeen, en de daaropvolgende intradermale uitdaging met het antigeen van de ontstekingsreactie in een bepaald huidgebied induceren. DTH reacties kunnen worden veroorzaakt aan verschillende antigenen, zoals ovalbumine, tuberculine, tetanustoxoïd of keyhole limpet hemocyanine (KLH).

Hier laten we zien hoe een actieve DTH reactie in Lewis ratten veroorzaken. We zullen een water-in-olie emulsie van KLH, onze antigeen van belang, eerst voor te bereiden in volledig Freund's adjuvans en subcutaan injecteren deze emulsie aan ratten. Dit zal premier van het immuunsysteem in het geheugen T-cellen gericht aan KLH te ontwikkelen. Zeven dagen later zullen we intradermaal uitdaging de ratten op de rug met KLH aan de ene kant en met ovalbumine, een irrelevante antigen, aan de andere kant. De ontstekingsreactie is zichtbaar 16 tot 72 uur later en de rode en gezwollen gebied zal worden gemeten als een indicatie van de DTH ernst.

Protocol

1. De voorbereiding van de emulsie

1. De emulsie is een 1:1 mengsel van antigeen (DTH kunnen ertoe worden aangespoord verschillende antigenen: ovalbumine, tetanustoxoïd, keyhole limpet hemocyanine ....) in waterige oplossing toegevoegd aan Freund's adjuvans te voltooien. Het is zeer belangrijk om het antigeen toe te voegen aan de hulpstof en niet andersom!
   
   
2. Er is een veel afval bij het maken van en het injecteren van een emulsie, dus altijd voor te bereiden 1,5 of 2 keer meer dan wat je nodig hebt.
   
   
3. Los antigeen in een zoutoplossing met een 2 mg / ml oplossing voor te bereiden. Geen filter, als je niet wilt dat de aggregaten verliezen!
   
   
4. Zet volledige Freund's adjuvans H37Ra (Difco, catalogus # 231.131) in een buis en vortex op hoge snelheid. Voeg de antigeen druppelsgewijs, terwijl vortexen. Wanneer alle van het antigeen wordt toegevoegd, vortex nog 5 minuten. Het mengsel moet wit worden.
   
   
5. Doe de emulsie in een glazen injectiespuit en een link naar een andere glazen injectiespuit met behulp van een 18G brug (Fisher catalogus # 14 tot 825-17L). Stuur de emulsie uit een spuit naar de andere totdat het wordt moeilijk (5-10 min). Het beste is om gebruik van twee 5 ml spuiten. Als er meer dan 5 ml van de emulsie nodig zijn, gebruik maken van verschillende sets van 5 ml spuiten.
   
   
6. De emulsie kan worden opgeslagen in de spuiten bij 4 ° C gedurende 3 weken.

2. Immunisatie van de ratten

1. Meng de emulsie in de spuiten voor een paar minuten en transfer naar de spuit die voor de injectie. Subcutaan injecteren 200 ml binnen 1-2 plaatsen aan de basis van de staart met behulp van 23G naalden en een Luer-Lok tip 3 ml spuit.

3. Uitdaging met antigeen in de rug

1. Zeven dagen na immunisatie, scheren 2 vlekken op de rug van de ratten en injecteer intradermaal 20 ml van een 1 mg / ml antigen oplossing in een plek en zout (of irrelevante antigeen) in de andere plek. NIET filter het antigeen-oplossing, zoals je misschien losse aggregaten die de ontstekingsreactie te versterken.
   
   
2. De ratten moeten anesthesized om bewegingen te voorkomen. Injecteer de oplossing intradermaal met behulp van 27G ½ naalden en 1 ml spuiten. Verandering naalden tussen de injecties.
   
   Let op: de uitdaging kan gedaan worden in de oorschelp van de oren in plaats van de rug voor meer nauwkeurige metingen. Zie video op http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Meting van DTH

1. De plaats van injectie zal beginnen te draaien rood en gezwollen als een teken van ontsteking. Meet de diameter van het ontstoken gebied met behulp van een liniaal of, beter nog, met een dikte. De maximale zwelling moet plaatsvinden tussen 24 en 72 uur.

Discussion

Voor een meer nauwkeurige meting van de DTH-reactie raden wij aan tegen de ratten met het antigeen in de oorschelp van het oor. De reactie kan dan worden gemeten als een verschil in het oor van zwelling tussen de relevante antigeen-uitgedaagd oor en het oor uitgedaagd met een zoutoplossing alleen of met de irrelevante antigeen. Een demonstratie van de uitdaging in het oor wordt getoond in een.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.