在这里,我们描述了一个高效的冷冻保存的方法和解冻皮质的脑组织块生成神经元文化的高度浓缩。这个简单的协议提供了神经元,星形胶质细胞和神经元前体细胞培养后一代的灵活性。
在这项研究中,我们勾勒出成功皮质的脑组织块冷冻保存和解冻生成神经元文化的高度浓缩的标准化协议。本议定书的冷冻介质使用的是10%的二甲基亚砜(DMSO)在汉克的缓冲盐溶液(HBSS)稀释。皮层组织块转移到含有冻结介质的离心管中,并慢慢地冻结在-1 ° C /分钟的速度控制冷冻集装箱。始终产生神经丰富的文化展出文化和神经网络的显着扩大,在第5天,10天之内迅速神经炎增长冰冻组织块解冻后的处理和分解。的星形胶质细胞标记神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元的标记β-微管蛋白Ⅲ类,免疫细胞化学染色显示培养的神经元和星形胶质细胞的数量高。组织块解离后的神经前体细胞培养新一代导致在迅速扩大的与众不同的条件下产生大量的神经元和星形胶质细胞的神经球,。这个简单的冷冻保存的协议,允许快速,高效,廉价的保存皮质的脑组织块,其中赠款为神经元,星形胶质细胞和神经元前体细胞培养后一代增加了灵活性。
冷冻保存提供了一个宝贵的脑组织样本,以供将来使用银行的机会。在这里,我们描述了一个简单而有效的的协议,同时生成神经元丰富的文化和神经前体细胞从冷冻的脑组织块。这种经济的过程避免了传统的冷冻保存技术,利用更昂贵的速率控制冰柜的成本。该协议允许可行的解冻后的神经元文化的一代提供一个快速而有效的的手段,以冻结组织块。整个冻结过程中可以采取低至20分钟。此外,使用这种方法组织块的初级神经元文化也可以被解冻后产生自由浮动的神经球生长的NPC。在这方面,在我们的冷冻介质血清缺乏确保细胞是未分化状态保存。与众不同的条件下,神经球生产从冰冻组织显示扩张和分化率从新鲜组织生成的神经球非常媲美。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是从本科生研究机会计划在UCI(AR和SP)赠款和赠款,从加州阿尔茨海默氏病的倡议和国家卫生部授予机构没有国家的支持。 HD38466,阿尔茨海默氏症研究中心授予没有。 AG16573(JB)
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X | |
Bovine calf serum supplemented | HYCLONE | SH30072.03 | For culture medium | |
Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | ||
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium | |
Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation | |
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4527-30KU | Tissue dissociation | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium | |
Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells | |
antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination | |
Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fischer Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells | |
Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific | 1111-2721 | ||
21 G1 precision guide needles | Beckton Dickinson | 305165 | To clean tissue | |
10 ml pipette | USA Scientific | 1071-0810 | Individually wrapped | |
50 ml tubes | USA Scientific | 926-9-04 | ||
Single edge razor blade | Smith Brand | 67-0238 | To chop tissue | |
60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | For general culture | |
100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0010 | For cleaning tissue | |
Cryogenic box | NALGENE Labware | 5026-1010 | ||
Freezing container | NALGENE Labware | 5100-0001 | “Mr. Frosty” | |
2.0 ml cryogenic vials | NALGENE Labware | 5012-0020 | ||
DMSO | Fischer Scientific | D128-500 | For freezing medium | |
Ethanol 200 proof | Sigma | E7023 | For sterilizing razor blade |