生成高度丰富的神经文化皮层组织块冷冻保存

Summary

在这里，我们描述了一个高效的冷冻保存的方法和解冻皮质的脑组织块生成神经元文化的高度浓缩。这个简单的协议提供了神经元，星形胶质细胞和神经元前体细胞培养后一代的灵活性。

Abstract

在这项研究中，我们勾勒出成功皮质的脑组织块冷冻保存和解冻生成神经元文化的高度浓缩的标准化协议。本议定书的冷冻介质使用的是10％的二甲基亚砜（DMSO）在汉克的缓冲盐溶液（HBSS）稀释。皮层组织块转移到含有冻结介质的离心管中，并慢慢地冻结在-1 ° C /分钟的速度控制冷冻集装箱。始终产生神经丰富的文化展出文化和神经网络的显着扩大，在第5天，10天之内迅速神经炎增长冰冻组织块解冻后的处理和分解。的星形胶质细胞标记神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元的标记β-微管蛋白Ⅲ类，免疫细胞化学染色显示培养的神经元和星形胶质细胞的数量高。组织块解离后的神经前体细胞培养新一代导致在迅速扩大的与众不同的条件下产生大量的神经元和星形胶质细胞的神经球，。这个简单的冷冻保存的协议，允许快速，高效，廉价的保存皮质的脑组织块，其中赠款为神经元，星形胶质细胞和神经元前体细胞培养后一代增加了灵活性。

Protocol

1。皮层组织块冷冻保存

材料的制备

1. 准备无菌水（1:9）的10倍原液稀释1X汉克的缓冲盐溶液（HBSS）。在摄氏4度商店的HBSS。
2. 准备10％DMSO冻存液稀释的HBSS（1:9）的二甲基亚砜。冻结介质应该是取得了新的冷冻保存前直到冷冻储存在摄氏4度。
3. 钢刀片是用于组织系统斩波。在使用之前，刀片被淹没在70％乙醇为2小时消毒。立即组织处理前，无菌水冲洗3次刀片。避免留在无菌水的剃须刀过多的时间，因为它很容易氧化。
4. 一个NALGENE冷冻集装箱装入离心管（2.5毫升），然后带进无菌生物柜。 1毫升的冰鲜冷冻介质添加到每一瓶。冷冻集装箱，然后放置在摄氏4度至少2小时。

清洗，切菜，和冻结

1. 被冻结的脑组织，脑膜膜和血管的清洁。使用无菌针尖小心地取下冰袋上工作时从组织的碎片。清理组织应轻轻冲洗与冷的HBSS，并转移到一个新的Petri砍菜。
2. 冰袋上工作，使用消毒的刀片，迅速 ​​组织切成约^1毫米的3块。清理组织工作的一小部分，在更好地控制在切菜过程中的时间结果，产生更均匀的块大小。
3. 在50 mL锥形管，慢慢地加入到50毫升的HBSS切碎组织。轻轻冲洗培养皿与HBSS中，以收集任何剩余的组织块。允许组织块下降到试管底部，建立一个松散的组织块颗粒。
4. 虽然该组织是解决生物安全柜，把先前冷冻的冷冻集装箱和冷冻管。摘帽所有的离心管，以加速加入组织的过程中。
5. 所有的组织块纷纷落户后，轻轻吸出多余的HBSS的，留下一个非常薄的层以上的颗粒的介质。离心气馁，因为它会导致组织块要坚持对方，冻结效率显着减少。
6. 使用广泛窍（切割用无菌剪刀尖）的枪头，慢慢地从底部的松散组织块颗粒收集200微升。的材料转移到一个离心管，从底部的沉淀下，再次收集组织。重要的是整个组织分配过程不超过3-4分钟每冷冻集装箱。这将确保该组织是暴露只是一个时间的冻结前的短期内，以二甲基亚砜。组织转移到小瓶后，放置至少4小时，在A - 80℃冷冻的冷冻集装箱。另外，冷冻集装箱可以在一夜之间，在-80℃。重复这个过程中，任何剩余的冷冻集装箱。
7. 从冷冻集装箱的冷冻管（S）转移到一个cryobox和长期储存在液氮罐。

2。解冻和冷冻皮层组织块的培养

材料的制备

1. 一天前解冻的组织样本，聚_- L -赖氨酸涂布培养皿/盖玻片准备。皮层神经元在一般情况下，我们准备用500微克/毫升或1毫克/毫升涂菜肴。加入足够的聚_- L -赖氨酸溶液（硼酸盐缓冲液中），全面覆盖的菜底部。如果需要盖玻片，确保它们完全淹没下聚_- L -赖氨酸的解决方案。孵育至少12小时。在使用之前，彻底的菜肴与自由主义的无菌水冲洗3次，每次5 min。
2. 暖的HBSS是用来清洁解冻组织以及组织分解成细胞悬液。取决于解冻组织的需要的HBSS数量会有所不同，但通常为1离心管会稀释在50毫升的HBSS，并将于10毫升的HBSS分离。
3. 贝科的改良Eagle中等10％的铁补充牛小牛血清（EBS）和1％的抗生素/ antimycotic（AA）的混合物（DMEM培养液(++))应放置在37℃水浴。
4. 电镀液（注(+++))应在使用前新鲜。这种介质是准备加入抗生素/ antimycotic加1％B27和N2补充剂。

注：媒体名称与穿越（+）追加指示列入媒体的碱基组成的添加剂。在这个文本中，DMEM培养液（+）表示DMEM培养液加10％EBS的加1％，AA，而NB (+++)表示注：PL我们的1％AA加B27的加氮气。

解冻和培养

1. 从液氮罐取出离心管，并迅速解冻在37 ° C直到水浴中只有一小冰粒是观察里面的小瓶内容。
2. 轻轻转移的内容，以温暖的HBSS 50毫升的小瓶，在一个锥形管。使用宽口尖轻轻驱逐任何剩余的组织块的离心管中卡住。反转管的3-4倍，并允许组织在底部慢慢收集。组织应该迅速解决，但如果块太小，这可能不会发生光离心（〜200 ×克）建议。
3. 吸干多余的HBSS。
4. 添加10毫升温暖的HBSS组织颗粒和300μL0.25％胰蛋白酶和50μLDNAase。在37℃水浴孵育5分钟，然后在轨道摇床设置为80 rpm和37 ° C的一个额外的5分钟。
5. 这一时期后，将进入生物安全柜的组织块，并用10 mL的吸管仔细搅动的组织块，直到形成阴天细胞悬液。停用温暖的DMEM培养液中添加10毫升的胰蛋白酶（+）的细胞悬液。
6. 1200 × 克 5分钟离心分离细胞。吸弃上清，在10毫升的温暖的DMEM重悬细胞沉淀（+ +）和量化使用血球细胞数。
7. 聚_- L -赖氨酸涂层菜肴板细胞。通常，一个60毫米的菜将被镀与1 × ¹⁰ 6细胞。
8. 允许细胞组织培养箱培养约1小时的菜/盖玻片的重视。建议在一个板块监测的附件的进展，每10分钟，直到有效附件。然后，轻轻地更换新鲜的DMEM (++).中期
9. 24小时后，更换的DMEM（+）用温水注(+++).部分介质的变化（50％）进行每5天用新鲜的NB (+++).健康的文化通常24小时后，进程的分化和增长的迹象。文化在这些条件下，执行部分介质的变化，每4-5天，可维持长时间的时间可达4-6周。
10. 对于生成的神经前体细胞（筹备），类似的协议，离心后，没有EBS的DMEM培养液的异常。细胞是镀金的T - 25的DMEM/F12（1:3），B27与表皮生长因子（20毫微克/毫升）的补充，让neuropheres形成烧瓶。要区分的NPC，神经球镀金层粘连蛋白（10微克/毫升）的DMEM/F12（1:3）培养基用N2涂盖玻片。

3。代表性的成果

健康的文化会表现出显着的生长和分化，后5天，解冻后，通常会在其增长稳定10天（图1）。这些文化Immuncocytochemical染色揭示众多的星形胶质细胞（图2A）和神经元对人类和大鼠原代神经元的文化（图2B）。此协议也适合对NPC的一代自由浮动的神经球（图3A），区分条件下，高品质（图3B，C）的混合培养的结果。

图1。冷冻人脑皮层组织细胞培养 ，冷冻的人脑皮层组织块接种于多聚赖氨酸涂布盖玻片解冻，生长10天。白天5细胞扩张明显，达到10天汇合。比例尺：100微米。

图2。细胞培养免疫细胞化学染色（A）培养染色标记的胶质神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP，厚箭头）。 （二）发现神经元与神经元的标记β-微管蛋白III（TIII，细箭头）。 （三）人类和鼠文化展示丰富的神经胶质细胞和神经元后的10天中文化。一抗：鼠抗GFAP（1:1000）和兔抗TIII（1:1000）。二抗：抗鼠Alexa的594（1:500）和抗兔Alexa的488（1:500）。核染色：Hoestch蓝色（1:1000）。比例尺：50微米。

图3。代神经球。（一）冰冻组织处理，如上所述，并允许传播神经球。 （二）神经球被镀上盖玻片与众不同的条件下生长10天，导致细胞从神经球迁移。 （三）这两种神经元和星形胶质细胞是目前在区分神经干扩大边缘。核counterstaining，如在图2中使用的小学和中学的抗体。

Discussion

冷冻保存提供了一个宝贵的脑组织样本，以供将来使用银行的机会。在这里，我们描述了一个简单而有效的的协议，同时生成神经元丰富的文化和神经前体细胞从冷冻的脑组织块。这种经济的过程避免了传统的冷冻保存技术，利用更昂贵的速率控制冰柜的成本。该协议允许可行的解冻后的神经元文化的一代提供一个快速而有效的的手段，以冻结组织块。整个冻结过程中可以采取低至20分钟。此外，使用这种方法组织块的初级神经元文化也可以被解冻后产生自由浮动的神经球生长的NPC。在这方面，在我们的冷冻介质血清缺乏确保细胞是未分化状态保存。与众不同的条件下，神经球生产从冰冻组织显示扩张和分化率从新鲜组织生成的神经球非常媲美。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995-073	High gluclose 1X
Bovine calf serum supplemented	Hyclone	SH30072.03	For culture medium
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	Invitrogen	1088-022
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	Supplement for Neurobasal medium
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Supplement for Neurobasal medium
Trypsin (10X)	Cellgro	25-054CI	Tissue dissociation
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)	Sigma-Aldrich	D4527-30KU	Tissue dissociation
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	GIBCO, by Life Technologies	14065	Cleaning tissue, washes, and freezing medium
Poly-L-Lysine- 500mg	Invitrogen	P2636	Substrate for adhesion of neuronal cells
antibiotic-antimycotic (100X), liquid	Invitrogen	15240-062	To prevent contamination
Large orifice pipette Tips (1-200 ul)	Fisher Scientific	02-681-141	To prevent shear stress to cells
Graduated pipette tips (101-1000 ul)	USA Scientific, Inc.	1111-2721
21 G1 precision guide needles	BD Biosciences	305165	To clean tissue
10 ml pipette	USA Scientific, Inc.	1071-0810	Individually wrapped
50 ml tubes	USA Scientific, Inc.	926-9-04
Single edge razor blade	Smith & Nephew Inc.	67-0238	To chop tissue
60 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0160	For general culture
100 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0010	For cleaning tissue
Cryogenic box	Nalge Nunc international	5026-1010
Freezing container	Nalge Nunc international	5100-0001	"Mr. Frosty"
2.0 ml cryogenic vials	Nalge Nunc international	5012-0020
DMSO	Fisher Scientific	D128-500	For freezing medium
Ethanol 200 proof	Sigma-Aldrich	E7023	For sterilizing razor blade