Summary
هنا ، نحن تصف طريقة لحفظ البرودة كفاءة وذوبان الكتل القشرية لتوليد أنسجة الدماغ العصبية الثقافات عالي التخصيب. هذا البروتوكول بسيطة توفر المرونة لجيل لاحق من الخلايا العصبية ، نجمية ، والثقافات الخلية العصبية السلائف.
Abstract
في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول موحد لحفظ البرودة ناجحة وذوبان الكتل القشرية لتوليد أنسجة الدماغ العصبية الثقافات عالي التخصيب. لهذا البروتوكول تجميد المتوسطة المستخدمة سلفوكسيد ثنائي ميثيل 10 ٪ (DMSO) المخفف في محلول ملح هانك في التخزين المؤقت (HBSS). يتم نقل كتل من الأنسجة إلى cryovials القشرية التي تتضمن تجميد المتوسطة والمجمدة ببطء في -1 درجة مئوية / دقيقة في وعاء معدل تسيطر عليها التجمد. بعد تحسن تجهيز وتفكك كتل الأنسجة العصبية المجمدة المنتجة باستمرار التخصيب الثقافات التي أظهرت نموا سريعا لالتهاب الأعصاب خلال ال 5 أيام الأولى في الثقافة والتوسع الكبير في شبكة الخلايا العصبية في غضون 10 يوما. كشفت تلطيخ Immunocytochemical مع نجمي البروتين الدبقية علامة الحمضية ييفي (GFAP) والعصبية علامة تويولين بيتا من الدرجة الثالثة ، أعداد كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الثقافات. نتج جيل من الخلايا العصبية الثقافات السلائف بعد تفكك كتلة الأنسجة في التوسع السريع neurospheres ، والتي أنتجت أعدادا كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في ظل ظروف التفريق. هذا البروتوكول يسمح الحفظ بالتبريد بسيطة للحفاظ على وسريعة فعالة وغير مكلفة لالقشرية كتل أنسجة المخ ، والذي يمنح مزيدا من المرونة لجيل لاحق من الخلايا العصبية ، نجمية ، والثقافات الخلية العصبية السلائف.
Protocol
1. الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية
تحضير مواد
- تحضير محلول ملح 1X هانك في التخزين المؤقت (HBSS) عن طريق تمييع الحل في الأسهم 10X في الماء المعقم (1:9). HBSS المحل في 4oC.
- إعداد 10 ٪ المتوسطة تجميد DMSO بواسطة تمييع DMSO في HBSS (1:9). وينبغي أن يتم تجميد المتوسطة الطازجة قبل الحفظ بالتبريد وتخزينها في 4oC حتى مبردة.
- ويستخدم شفرة حلاقة الصلب لتقطيع منهجي من الأنسجة. قبل الاستخدام ، يتم تعقيمها بواسطة شفرة حلاقة الانغمار في الإيثانول 70 ٪ لمدة 2 ساعة. على الفور قبل معالجة الأنسجة ، وشطف شفرة حلاقة مع الماء المعقم 3 مرات. تجنب ترك الحلاقة في الماء المعقم للحصول على كمية زائدة من الزمن ، كما هي عرضة للأكسدة.
- تم تحميل الحاويات مع تجميد Nalgene cryovials (2.5 مل) ومن ثم إحضاره إلى مجلس الوزراء بيولوجية معقمة. يضاف 1 مل من المتوسط تجميد مبردة إلى كل قنينة. ثم يتم وضع الحاوية في 4oC تجميد ما لا يقل عن 2 ساعة.
التنظيف ، والتقطيع ، والتجميد
- يتم تنظيف أنسجة المخ لتكون الأغشية السحائية المجمدة والأوعية الدموية. نصائح استخدام إبرة معقمة لإزالة الحطام بعناية من النسيج بينما كان يعمل على رأس وضع كيس من الثلج. يجب شطف الأنسجة تنظيفها برفق مع HBSS الباردة ونقل إلى طبق بيتري جديدة لتقطيع.
- العمل على أعلى وضع كيس من الثلج ، واستخدام شفرة حلاقة معقمة لختم بسرعة النسيج في كتل ما يقرب من 1 3 مم. العمل مع أجزاء صغيرة من أنسجة تنظيفها على نتائج أفضل في الوقت السيطرة على التقطيع الداخلي ، مما أسفر عن أحجام كتلة موحدة أكثر.
- إضافة ببطء الأنسجة المقطعة إلى 50 مل من HBSS في أنبوب مخروطي 50 مل. الشطف بلطف طبق بيتري مع HBSS من أجل جمع أي كتل الأنسجة المتبقية. السماح للكتل الأنسجة أن ينزل إلى أسفل الأنبوب ، وخلق كتلة الأنسجة معبأة فضفاضة بيليه.
- في حين أن الأنسجة تسوية ، وجلب الحاويات المبردة سبق تجميدها وcryovials في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إرفع قبعة جميع cryovials للإسراع في عملية إضافة الأنسجة.
- بعد كل الكتل الأنسجة استقروا ، نضح بلطف HBSS الزائدة ، وترك طبقة رقيقة جدا من وسائل الاعلام فوق بيليه. تم تخيف الطرد المركزي كما انها سوف تتسبب في كتل الأنسجة التمسك بعضها البعض ، مما يقلل بشكل كبير كفاءة التجميد.
- جمع ببطء 200 ميكرولتر من الجزء السفلي من بيليه كتلة الأنسجة فضفاض باستخدام ماصة غيض مع فتحات واسعة (خفض الحافة مع مقص العقيمة). نقل المواد إلى أحد cryovial والانتقال إلى الأنسجة ، وجمع القادم مرة أخرى من الجزء السفلي من بيليه. فمن الضروري أن تخصيص نسيج كامل الإجراء لا يستغرق أكثر من دقيقة 3-4 في حاوية التجمد. هذا يضمن أن ما يتعرض له الأنسجة لDMSO لفترة قصيرة فقط من الوقت قبل التجميد. بعد نقل الأنسجة إلى قارورة ، ومكان الحاوية تجميد في الثلاجة - 80oC مدة لا تقل عن 4 ساعات. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الحاوية بين عشية وضحاها في تجميد -80 درجة مئوية. كرر هذه العملية عن أي حاويات تجميد المتبقية.
- نقل الحاويات من cryovials تجميد (ق) إلى cryobox ومكان في خزان النتروجين السائل لمدة طويلة الأجل للتخزين.
2. وذوبان كتل مجمدة التثقيف من الأنسجة القشرية
تحضير مواد
- قبل يوم واحد لعينات الأنسجة ذوبان ، وبولي - L - يسين المغلفة أطباق بتري / coverslips مستعدون. بصفة عامة ، لأننا العصبونات القشرية إعداد أطباق المغلفة مع 500 ميكروغرام / مل أو 1mg / مليلتر. إضافة ما يكفي من بولي - L - حل ليسين (صنع في المخزن بورات) لتغطية كامل الجزء السفلي من الطبق. إذا كانت هناك حاجة coverslips الزجاج ، وضمان أنها غارقة تماما في إطار حل بولي - L - يسين. احتضان ما لا يقل عن 12 ساعة. قبل الاستخدام ، وشطف الأطباق جيدا مع كمية من الماء المعقم ليبرالية 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما.
- يستخدم HBSS الدافئ لتنظيف الأنسجة المذوبة وكذلك لفصل الأنسجة في التعليق الخلية. فإن حجم HBSS حاجة تختلف تبعا لكمية من الأنسجة لتكون تحسنت ، ولكن عادة 1 cryovial سوف تضعف في 50 مل من HBSS وسيتم فصلها في 10 مل من HBSS.
- متوسطة Dulbecco في التعديل مع النسر 10 ٪ الحديد العجل البقري تستكمل المصل (EBS) ، و 1 ٪ للمضادات الحيوية / مضاد فطري (AA) خليط (يجب وضع DMEM (++))في حمام مائي 37 ° C.
- الطلاء المتوسطة (ينبغي بذل NB (+++))الطازجة قبل استخدامها. أعد هذه الوسيلة 1 ٪ عن طريق إضافة المضادات الحيوية / مضاد فطري زائد والمكملات B27 N2.
ملاحظة : أسماء وسائل الإعلام إلحاق مع الصلبان (+) تشير إلى إدراج الإضافات لتكوين قاعدة من وسائل الإعلام. في هذا النص ، DMEM (+ +) تعني DMEM EBS زائد 10 ٪ زائد 1 ٪ AA ، بينما يدل NB NB (+++)ررلنا 1 ٪ AA زائد زائد B27 N2.
ذوبان الجليد والتثقيف
- إزالة cryovials من خزان النتروجين السائل وذوبان الجليد بسرعة على 37 درجة مئوية ويلاحظ في حمام مائي حتى مجرد بيليه الثلج الصغيرة داخل محتوى القارورة.
- نقل محتوى القارورة بلطف ل50mL من HBSS الدافئة في أنبوب مخروطي. استخدام غيض فوهة واسعة لطرد بلطف أي كتل الأنسجة المتبقية عالقة في cryovial. عكس الأنبوب 3-4 مرات ، والسماح للأنسجة لجمع ببطء في القاع. وينبغي تسوية الأنسجة بسرعة ، ولكن إذا كانت كتل صغيرة جدا وهذا قد لا يحدث والضوء الطرد المركزي (~ 200 × ز) هو الموصى بها.
- نضح HBSS الزائدة.
- إضافة 10 مل من HBSS الحارة لبيليه الأنسجة و 300 ميكرولتر من التربسين 0.25 ٪ و 50 ميكرولتر من DNAase. تعيين احتضان في حمام مائي 37 ° مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم وضع في المدار شاكر إلى 80 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ل5 دقائق إضافية.
- بعد هذه الفترة ، وجلب كتل الأنسجة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية واستخدام ماصة 10 مل تحرض بعناية كتل الأنسجة حتى يتم تشكيل خلية تعليق غائما. تنشيط التربسين بإضافة 10 مل من DMEM الدافئة (+ +) إلى تعليق الخلية.
- الطرد المركزي الخلايا في فصل ز × 1200 لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف ، resuspend الكرية خلية في 10 مل من DMEM الدافئة (+ +) وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- لوحة الخلايا على بولي - L - يسين الأطباق المغلفة. عادة ، سيتم مطلي طبق من عيار 60 ملم مع الخلايا 6 1x10.
- السماح للخلايا لإرفاق الطبق / coverslips لحوالي 1 ساعة في الأنسجة حاضنة الثقافة. فمن المستحسن لرصد التقدم المحرز في مرفق واحد لوحة كل 10 دقيقة حتى لاحظ المرفق الفعال. ثم ، استبدال بلطف المتوسطة مع (++).DMEM جديدة
- بعد 24 ساعة ، ويحل محل DMEM (+ +) مع ملاحظة (+++).الدافئة وتجرى التغييرات الجزئية المتوسطة (50 ٪) من أصل كل 5 أيام مع ملاحظة (+++).جديدة ثقافات صحية وعادة ما تظهر علامات التمايز ونمو العمليات بعد 24 ساعة. في ظل هذه الظروف ، وأداء التغييرات الجزئية المتوسطة كل 4-5 أيام ، ويمكن المحافظة على الثقافات لفترات طويلة من الزمن تصل إلى 4-6 أسابيع.
- لتوليد الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات) ، يتم استخدام بروتوكول مماثل باستثناء أنه بعد الطرد المركزي ، ويستخدم DMEM دون EBS. ومطلي الخلايا في قوارير T - 25 في DMEM/F12 (1:3) ، وتستكمل مع B27 EGF (20 نانوغرام / مل) للسماح بتشكيل neuropheres. للتمييز بين الشخصيات ، ومطلي neurospheres على laminin (10 ميكروغرام / مل) coverslips المغلفة في DMEM/F12 (1:3) متوسطة تستكمل مع N2.
3. ممثل النتائج
سوف تظهر ثقافات صحية نمو كبير وتمايز بعد 5 أيام بعد ذوبان الجليد ، وسوف تستقر عادة في نموه بنسبة 10 يوما (الشكل 1). تلطيخ Immuncocytochemical من هذه الثقافات ويكشف العديد من الخلايا النجمية (الشكل 2A) والخلايا العصبية (الشكل 2B) للثقافات البشرية والفئران العصبية الأولية. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لجيل من الشخصيات والتعويم الحر neurospheres (الشكل 3A) ، الذي ظل ظروف التفريق ، نتيجة عالية الجودة في ثقافات متباينة (الشكل 3B ، C).
الشكل 1. يتم إذابة الثقافات الخلية القشرية من الأنسجة المجمدة الإنسان. مجمدة كتل الأنسجة البشرية القشرية ومطلي على بولي يسين coverslips المغلفة ونمت لمدة 10 يوما. قبل 5 أيام توسيع الخلية هو واضح ، واليوم يتحقق confluency 10. شريط الحجم : 100 ميكرومتر.
الشكل 2. تلطيخ Immunocytochemical الثقافات الخلية (أ) كانت ملطخة الثقافات مع الدبقية البروتين الدبقية علامة ييفي الحمضية (GFAP والسهام سميكة). (ب) تم الكشف عن الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية ثالثا بيتا تويولين علامة (TIII والسهام رقيقة). (ج) كل من الإنسان والفئران تبين الدبقية الثقافات وفيرة والخلايا العصبية بعد 10 يوما في الثقافة. الابتدائية الأضداد : الماوس المضادة للGFAP (1:1000) والمضادة للأرنب TIII (1:1000). الأجسام المضادة الثانوية : الألغام المضادة للماوس اليكسا 594 (1:500) والمضادة للأرنب اليكسا 488 (1:500). تلطيخ النوى : Hoestch الأزرق (1:1000). شريط الحجم : 50 ميكرون.
الشكل 3. جيل من neurospheres : (أ) تمت معالجة الأنسجة المجمدة على النحو الموصوف أعلاه ، وسمح للنشر وneurospheres. (ب) كانت مطلية Neurospheres coverslips على الزجاج في ظل ظروف التفرقة ونمت لمدة 10 يوما ، مما أدى إلى الخلايا المهاجرة بعيدا عن neurosphere. (ج) كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية موجودة في توسيع هامش من neurosphere التفريق. counterstaining النووية ، والأجسام المضادة الابتدائية والثانوية كما هو مستخدم في الشكل 2.
Discussion
الحفظ بالتبريد يوفر فرصة ثمينة لعينات من أنسجة المخ البنك لاستخدامها في المستقبل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لكنها فعالة لتوليد كل من الخلايا العصبية التخصيب الثقافات والخلايا العصبية من السلائف المجمدة كتل أنسجة المخ. هذا الإجراء اقتصادية تتجنب تكاليف تقنيات الحفظ بالتبريد التقليدية التي تستخدم أكثر تكلفة سعر المجمدات التي تسيطر عليها. بروتوكول يسمح للجيل الثقافات العصبية قابلة للحياة ما بعد ذوبان الجليد عن طريق توفير وسيلة سريعة لكنها فعالة لتجميد كتل الأنسجة. يمكن لعملية تجميد كامل يستغرق اقل من 20 دقيقة. بالإضافة إلى الثقافات العصبية الأولية ، ويمكن استخدام هذا الأسلوب كتل الأنسجة أيضا إذابة لتوليد الشخصيات كما نمت neurospheres التعويم. في هذا الصدد ، عدم وجود مصل لدينا في المتوسط تجميد يضمن الحفاظ على الخلايا في حالة غير متمايزة. في ظل ظروف التفريق ، أنتجت neurospheres من الأنسجة المجمدة ومعدلات التوسع اظهار تمايز مشابه جدا لneurospheres المتولدة من أنسجة جديدة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من برنامج بحوث فرص الدراسة الجامعية في الاتحاد الدولي للدراجات (AR وSP) والمنح المقدمة من الدولة لمبادرة كاليفورنيا مرض الزهايمر والمعاهد الوطنية للصحة منح أي. HD38466 ، ومرض الزهايمر مركز أبحاث منحة لا. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J.
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
