Summary
Burada, biz verimli dondurulması için bir yöntem tarif ve zenginleştirilmiş nöronal kültürlerini oluşturmak için kortikal beyin dokusu blokları çözülme. Bu basit protokol, nöronal astrosit ve nöronal prekürsör hücre kültürlerinin sonraki nesil için esneklik sağlar.
Abstract
Bu çalışmada, biz, başarılı bir şekilde dondurulması ve zenginleştirilmiş nöronal kültürlerini oluşturmak için kortikal beyin dokusu blokları çözülme için standart bir protokol özetlemektedir. Bu protokolü için kullanılan donma orta Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) seyreltilmiş% 10 dimetil sülfoksit (DMSO). Kortikal doku blokları, donma orta içeren cryovials transfer ve yavaş yavaş -1 ° C / dak hızı kontrollü bir dondurma kabı dondurulur. Post-çözülme işleme ve sürekli olarak 10 gün içinde ilk 5 günü kültür ve nöron ağının önemli bir genişleme sırasında hızlı nöritik büyüme sergiledi zenginleştirilmiş nöronal kültürlerin dondurulmuş doku blokları ayrılma. Astrositik marker glial fibriller asidik protein (GFAP) ve nöronal belirteç beta-tubulin sınıf III, İmmünositokimyasal boyanması kültürlerin astrositler nöronlar ve yüksek sayıda ortaya çıkardı. Doku blok disosiasyon sonra nöral prekürsör hücre kültürlerinde üretilmesi hızla farklılaşan koşullar altında çok sayıda nöron ve astrosit neurospheres genişleyen sonuçlandı. Bu basit kriyoprezervasyon protokolü kortikal beyin dokusu blokları, nöronal astrosit ve nöronal prekürsör hücre kültürlerinin sonraki nesil için daha fazla esneklik hibe hızlı, verimli ve ucuz korunması, sağlar.
Protocol
1. Kortikal Doku Blokları, Kriyoprezervasyon
Malzeme Hazırlığı
- 10X stok solüsyonu steril su (1:9) seyreltilmesi 1X Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) hazırlayın. 4oC saklayın HBSS.
- HBSS (1:9) DMSO seyreltilmesi ile% 10 DMSO dondurma orta hazırlayın. Dondurma orta kriyoprezervasyon önce taze, soğutulmuş kadar yapılan ve 4oC saklanan olmalıdır.
- Çelik tıraş bıçağı, doku sistematik doğramak için kullanılır. Kullanmadan önce, tıraş bıçağı, 2 saat için% 70 etanol içinde boğulma yolu ile sterilize edilmiştir. Doku işleme hemen önce tıraş bıçağı, 3 kez steril su ile durulayın. Oksidasyon eğilimli olduğu gibi, bir zaman aşırı miktarda steril su jilet bırakarak kaçının.
- Bir Nalgene dondurma kabı cryovials (2.5 mL) ile yüklenir ve daha sonra steril bir biyolojik kabin içine getirilir. Her flakon 1 ml soğutulmuş dondurma orta eklenir. Dondurma kabı sonra en az 2 saat için 4oC yerleştirilir.
Temizleme, Doğrama ve Donma
- Meningeal membran ve kan damarlarının donmuş gibi beyin dokusu temizlenir. Bir buz paketi üzerinde çalışırken, doku dikkatle enkaz kaldırmak için steril iğne ipuçlarını kullanın. Temizlenmiş doku hafifçe soğuk HBSS ile durulanır ve doğrama için yeni bir Petri kabı transfer edilmelidir.
- Bir buz paketi üstünde çalışarak, yaklaşık 1 mm 3 blok halinde hızla doku chop steril bir jilet kullanın. Temizlenir doku küçük porsiyonlar, daha düzgün blok boyutları, kesme işlemi üzerinde daha iyi kontrol bir zaman sonuçları ile çalışma.
- HBSS 50 ml 50 ml konik tüp içine doğranmış dokusu yavaş yavaş ekleyin. HBSS ile Petri kabında kalan herhangi bir doku blokları toplamak için nazikçe yıkayın. Gevşekçe paketlenmiş bir doku blok pelet oluşturmak doku blokları, tüpün dibine inmek için izin verin.
- Doku yerleşme iken, biyolojik güvenlik kabininin içine önceden soğutulmuş dondurma kabı ve cryovials getirmek. Doku ekleme süreci hızlandırmak için bütün cryovials şapkasını çıkarmak.
- Tüm doku blokları yerleştikten sonra, yavaşça, pelet yukarıda medya çok ince bir tabaka bırakarak aşırı HBSS aspirat. Doku blokları birbirine yapışır neden olacaktır Santrifüj, donma verimliliği önemli ölçüde azalan önerilmez.
- 200 mcL geniş orifisleri (steril makas ile ucu kesim) pipet kullanarak gevşek doku blok pelet alttan yavaş yavaş topluyoruz. Cryovial bir malzeme transferi ve pelet alttan sonraki tekrar toplanması doku geçmek. Tüm doku tahsis usulü dondurma konteyner başına 3-4 dk daha fazla olmadığını esastır. Bu doku, dondurmadan önce zaman sadece kısa bir süre için DMSO maruz kaldığı sağlar. Şişeleri doku aktardıktan sonra, en az 4 saat süreyle bir-80oC dondurucu dondurma kabı yerleştirin. Alternatif olarak, dondurma kabı -80 oC bir gecede terk edilebilir. Kalan herhangi bir dondurma kapları için bu işlemi tekrarlayın.
- Donma konteyner (ler), uzun süreli depolama için bir sıvı nitrojen tankı cryobox ve yer cryovials aktarın.
2. Dondurulmuş Kortikal Doku Blokları Çözülme ve ekimi
Malzeme Hazırlığı
- Bir gün önce çözülme doku örnekleri, poli-L-lizin kaplı Petri kutularına / lamelleri hazırlanmıştır. Genel olarak, kortikal nöronların için 500 mcg / mL veya 1 mg / ml ile kaplı yemekleri hazırlamak. Tam çanak alt kapağı için yeterli poli-L-lisin çözüm (borat tamponu yapılan) ekleyin. Cam lamelleri gerekiyorsa, poli-L-lisin çözümü tamamen altında kalmış olduğundan emin olun. En az 12 saat süreyle inkübe edin. Kullanmadan önce iyice liberal bir miktarda steril su ile 3 kez, her biri 5 dakika bulaşıkları yıkayın.
- Sıcak HBSS çözülmüş dokusunun yanı sıra doku hücre süspansiyonları ayırmak temizlemek için kullanılır. Gerekli HBSS hacmi çözülmüş olması doku miktarına bağlı olarak değişir, ancak tipik olarak 1 cryovial HBSS 50 ml seyreltik ve 10 ml HBSS ayrışmış olacak.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta% 10 demir takviye sığır buzağı serumu (EBS) ve% 1 / antibiyotik antimikotik (AA) karışımı (37 ° C su banyosunda DMEM (++)) konulmalıdır.
- Kaplama orta (NB (+++)) kullanımdan önce taze yapılmalıdır. Bu ortam, antibiyotik% 1 / antimikotik artı B27 ve N2 takviyeleri ekleyerek hazırlanır.
Not: Medya isimleri çarpılar (+) ile eklenen katkı maddeleri de dahil medya baz bileşimi göstermektedir. Bu metinde, DMEM (+) gösterir DMEM artı 10% EBS artı% 1 AA ise NB (+++) gösterir NB plbize% 1 AA artı B27 artı N2.
Çözülme ve Kültürleme
- Sıvı nitrojen tankı cryovials çıkarın ve hızlı bir şekilde 37 Çözülme ° C su banyosu, sadece küçük bir buz pelet kadar flakon içeriği içinde gözlenir.
- Hafifçe konik bir tüp içerisinde 50 ml sıcak HBSS flakon içerik aktarmak. Cryovial sıkışıp kalan doku blokları nazikçe çıkarmak için geniş bir orifis ucu kullanın. Tüp 3-4 kez çevirin ve dokusu yavaş yavaş alt toplamak için izin verir. Doku hızlı bir şekilde çözmek gerekir, ama bloklar çok küçük, bu tavsiye edilir santrifüj (~ 200 x g) oluşur ve ışık olmayabilir.
- Aşırı HBSS aspire.
- Doku pelet ve 300% 0.25 tripsin ve DNAase 50 mcL mcL sıcak HBSS 10 ml ekleyin. Orbital çalkalayıcı 5 dakika sonra, yer için 37 ° C su banyosunda inkübe ek bir 5 dakika için 80 ° C rpm ve 37 olarak ayarlayın.
- Bu dönemden sonra, biyolojik güvenlik kabini içine doku blokları getirmek ve bulutlu bir hücre süspansiyon oluşuncaya kadar dikkatlice doku blokları karıştırma 10 ml pipet kullanın. 10 ml sıcak DMEM ekleyerek tripsin devre dışı bırakın (+ +) hücre süspansiyonu.
- 5 dakika boyunca 1200 x g ayrışmış hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve atın, 10 ml sıcak DMEM hücre pelletini tekrar süspansiyon (+ +) ve hemasitometre kullanarak hücre sayısı belirlenir.
- Poli-L-lisin kaplı yemekler Plaka hücreleri. Tipik olarak, bir 60 mm çanak 1x10 6 hücreleri ile kaplı olacaktır.
- Hücrelerin doku kültürü inkübatörde yaklaşık 1 saat için çanak / lamelleri eklemek için izin ver. Bu etkili ek görülmektedir kadar her 10 dakikada bir tabak eki ilerlemeyi izlemek için tavsiye edilir. Sonra, yavaşça orta yerine taze DMEM (++).
- 24 saat sonra, DMEM replace (+) sıcak NB (+++). Kısmi orta değişiklikler (% 50), taze NB (+++). ile her 5 günde bir yapılmaktadır Sağlıklı kültürler genellikle 24 saat sonra farklılaşma ve büyüme süreçleri belirtilerini gösteriyor. Bu koşullar altında, her 4-5 günde kısmi orta değişiklikleri gerçekleştirirken, kültürleri, 4-6 hafta kadar zaman uzun süre muhafaza edilebilir.
- Nöronal prekürsör hücreler (NPC) üretimi için de benzer bir protokol santrifüj sonra, EBS olmadan DMEM olduğunu haricinde kullanılır. Hücreler neuropheres oluşumuna izin B27 ve EGF (20 ng / ml) ile desteklenmiş DMEM/F12 (1:3), T-25 şişeler kaplanmıştır. NPC'ler ayırt etmek için, neurospheres laminin (10 ug / ml), DMEM/F12 (1:3) N2 ile desteklenmiş orta kaplamalı lamelleri kaplanmıştır.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Sağlıklı kültürler, 5 gün post-çözülme sonra, önemli bir büyüme ve farklılaşma gösterecek ve genellikle 10 gün (Şekil 1) büyüme stabilize edecek. Bu kültürlerin Immuncocytochemical boyanması ortaya koyan ve sayısız astrositler (Şekil 2A), hem insan ve fare primer nöronal kültürler için nöronlar (Şekil 2B). Bu protokol aynı zamanda serbest yüzen neurospheres (Şekil 3A), ayırt koşulları altında, yüksek kalitede karışık kültürler (Şekil 3B, C) sonuç olarak NPC'ler üretimi için uygundur.
Şekil 1. Donmuş insan kortikal doku hücre kültürleri Dondurulmuş insan kortikal doku blokları çözülmüş ve poli-lizin kaplı lamelleri kaplama ve 10 gün boyunca yetişen. Geçen gün 5 hücre genişleme görülür ve gündüz 10 confluency elde edilir. Ölçek çubuğu: 100 mm.
Şekil 2. Hücre kültürlerinin İmmünositokimyasal boyama (A) Kültürler glial marker glial fibriller asidik protein (GFAP, kalın oklar) ile boyandı. (B) Nöronlar nöronal belirteç beta-tubulin III (TIII ince oklar) ile tespit edildi. (C) Her ikisi de insan ve sıçan kültürleri kültür 10 gün sonra bol glia ve nöronlar göstermektedir. İlköğretim antikorlar: fare anti-GFAP (1:1000) ve tavşan anti-TIII (1:1000). İkincil antikorlar anti-fare Alexa 594 (1:500) ve anti-tavşan Alexa 488 (1:500). Çekirdekler boyama: Hoestch mavi (1:1000). Ölçek çubuğu: 50 mm.
Şekil 3. Neurospheres nesil (A) Dondurulmuş doku, yukarıda açıklandığı ve neurospheres yaymak için izin olarak işlendi . (B) Neurospheres neurosphere uzak göç hücreleri, farklılaşan koşullar altında cam lamelleri kaplama ve 10 gün için yetiştirilir. (C), her ikisi de ayırt neurosphere genişleyen saçak nöronlar ve astrositler mevcut. Nükleer counterstaining, Şekil 2 olarak kullanılan birincil ve ikincil antikorlar.
Discussion
Kriyoprezervasyon gelecekte kullanılmak üzere banka değerli beyin doku örnekleri için bir fırsat sunuyor. Burada nöron zengin kültürleri ve nöronal prekürsör hücreler dondurulmuş beyin dokusu blokları oluşturmak için basit ama etkili bir protokol açıklar. Bu ekonomik prosedürü hız kontrollü dondurucular daha pahalı kullanan geleneksel kriyoprezervasyon teknikleri maliyetlerini ortadan kaldırır. Hızlı ama etkili bir araç sağlayarak doku blokları donma-çözülme sonrası canlı nöronal kültürlerin üretimi için protokol sağlar. Tüm dondurma işlemi en az 20 dakika sürebilir. Primer nöronal kültürlerin yanı sıra, bu yöntemi doku blokları kullanarak serbest dalgalı neurospheres olarak yetiştirilen NPC'ler oluşturmak için çözülmüş olabilir. Bu bağlamda, bizim dondurma orta serum eksikliği hücreleri farklılaşmamış bir devlet korunmuş olmasını sağlar. Neurospheres farklılaşan koşullar altında, dondurulmuş doku gösterisi genişleme ve taze doku elde neurospheres çok karşılaştırılabilir farklılaşma oranları üretti.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, UCI (AR ve SP) Lisans Araştırma Fırsatlar Programı hibe ve hibe Devlet California Alzheimer Hastalığı Girişimi ve hayır, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. HD38466 ve Alzheimer Hastalığı Araştırma Merkezi hiçbir hibe. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J.
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
