यहाँ, हम कुशल cryopreservation के लिए एक विधि का वर्णन और cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के विगलन अत्यधिक समृद्ध neuronal संस्कृतियों उत्पन्न. यह सरल प्रोटोकॉल neuronal, astrocyte, और neuronal अग्रदूत सेल संस्कृतियों के बाद की पीढ़ी के लिए लचीलापन प्रदान करता है.
इस अध्ययन में, हम सफल cryopreservation और cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के विगलन अत्यधिक समृद्ध neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा. इस प्रोटोकॉल के लिए ठंड इस्तेमाल किया मध्यम 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) हांक buffered नमक समाधान (HBSS) में पतला है. Cortical ऊतक के ब्लाकों ठंड मध्यम युक्त cryovials को हस्तांतरित कर रहे हैं और धीरे धीरे -1 डिग्री सेल्सियस दर नियंत्रित ठंड कंटेनर में / मिनट पर जमे हुए हैं. पोस्ट पिघलना प्रसंस्करण और जमे हुए ऊतक लगातार neuronal समृद्ध संस्कृतियों जो संस्कृति और neuronal नेटवर्क के विस्तार में महत्वपूर्ण में पहले 5 दिनों के दौरान 10 दिनों के भीतर तेजी से neuritic वृद्धि प्रदर्शन का उत्पादन ब्लॉक के पृथक्करण. Astrocytic मार्कर glial fibrillary अम्लीय (GFAP) प्रोटीन और neuronal मार्कर बीटा ट्यूबिलिन वर्ग III, के साथ Immunocytochemical धुंधला हो जाना और संस्कृतियों में न्यूरॉन्स और astrocytes की उच्च संख्या का पता चला. तंत्रिका ऊतक ब्लॉक हदबंदी के बाद अग्रदूत सेल संस्कृतियों की पीढ़ी तेजी से neurospheres, जो फर्क शर्तों के तहत न्यूरॉन्स और astrocytes की बड़ी संख्या का उत्पादन विस्तार में हुई. यह सरल cryopreservation प्रोटोकॉल cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के तेजी से, कुशल और सस्ती संरक्षण, जो neuronal, astrocyte, और neuronal अग्रदूत सेल संस्कृतियों के बाद की पीढ़ी के लिए बढ़ लचीलेपन के अनुदान के लिए अनुमति देता है.
Cryopreservation बैंक भविष्य में उपयोग के लिए कीमती मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों के लिए एक अवसर प्रदान करता है. यहाँ हम एक सरल लेकिन प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए दोनों न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक से neuronal कोशिकाओं अग्रदूत उत्पन्न. यह किफायती प्रक्रिया पारंपरिक cryopreservation तकनीक है कि अधिक महंगी दर नियंत्रित फ्रीजर का उपयोग की लागत से बचा जाता है. प्रोटोकॉल व्यवहार्य neuronal संस्कृतियों के बाद विगलन की पीढ़ी के लिए एक तेजी से अभी तक प्रभावी साधन प्रदान करने के लिए ऊतक ब्लॉक फ्रीज द्वारा की अनुमति देता है है. पूरे जमने की प्रक्रिया के रूप में छोटा रूप में 20 मिनट लग सकते हैं. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के अलावा, इस विधि ऊतक ब्लॉक का उपयोग भी मुक्त अस्थायी neurospheres के रूप में हो NPCs उत्पन्न thawed जा सकता है. इस संबंध में, हमारे ठंड माध्यम सीरम की कमी सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को एक undifferentiated राज्य में संरक्षित कर रहे हैं. फर्क शर्तों के तहत, neurospheres जमी ऊतक शो विस्तार और भेदभाव बहुत ताजा ऊतकों से उत्पन्न neurospheres करने के लिए तुलनीय दरों से उत्पादन किया.
The authors have nothing to disclose.
इस शोध UCI (ए आर और सपा) में अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवसर कार्यक्रम से अनुदान और कैलिफोर्निया अल्जाइमर रोग पहल और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान का कोई संस्थान के राज्य से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. HD38466, और अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र अनुदान नहीं. AG16573 (जेबी)
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X | |
Bovine calf serum supplemented | HYCLONE | SH30072.03 | For culture medium | |
Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | ||
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium | |
Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation | |
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4527-30KU | Tissue dissociation | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium | |
Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells | |
antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination | |
Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fischer Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells | |
Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific | 1111-2721 | ||
21 G1 precision guide needles | Beckton Dickinson | 305165 | To clean tissue | |
10 ml pipette | USA Scientific | 1071-0810 | Individually wrapped | |
50 ml tubes | USA Scientific | 926-9-04 | ||
Single edge razor blade | Smith Brand | 67-0238 | To chop tissue | |
60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | For general culture | |
100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0010 | For cleaning tissue | |
Cryogenic box | NALGENE Labware | 5026-1010 | ||
Freezing container | NALGENE Labware | 5100-0001 | “Mr. Frosty” | |
2.0 ml cryogenic vials | NALGENE Labware | 5012-0020 | ||
DMSO | Fischer Scientific | D128-500 | For freezing medium | |
Ethanol 200 proof | Sigma | E7023 | For sterilizing razor blade |