Summary
מזדהות סיבים electrospun ישיר על גדילה של נוירונים במבחנה הם מרכיב הפוטנציאל של פיגומים התחדשות עצבים. אנו מתארים את הליך הכנת מצעים electrospun סיבים ותרבות חופשית בסרום של חושי העיקרי עכברוש E15 (DRG) ו הנוירונים המנוע. ויזואליזציה של נוירונים ידי immunocytochemistry כלולה גם.
Abstract
Electrospinning היא טכניקה לייצור מיקרו כדי בקנה מידה ננו סיבים. סיבים יכולים להיות electrospun בדרגות שונות של יישור, החל בציר מאוד אקראי לחלוטין. בנוסף, הסיבים ניתן סובב ממגוון רחב של חומרים, לרבות פולימרים מתכלים כגון חומצה פולי-L-לקטית (PLLA). מאפיינים אלה הופכים סיבי electrospun מתאים למגוון יישומים פיגומים בהנדסת רקמות. המיקוד שלנו הוא על שימוש בסיבי electrospun מיושר עבור התחדשות עצבים. הראינו בעבר כי מיושר electrospun סיבים PLLA תוצאה ישירה של שני נוירונים החושי והמוטורי ראשוני במבחנה. אנו סבורים כי השימוש במערכת התא הראשוני תרבות חיוני בעת הערכת biomaterials לנוירונים המודל האמיתי נמצא vivo ככל האפשר. כאן אנו מתארים טכניקות בשימוש במעבדה שלנו electrospin פיגומים סיבי ואת הגב תרבות שורש explants הגרעינים, כמו גם נוירונים החושי והמוטורי ניתק, על פיגומים electrospun. עם זאת, ועל electrospinning / או טכניקות תרבות המוצגים כאן ניתנים להתאמה בקלות לשימוש ביישומים אחרים.
Protocol
1. פולי-L-חומצה לקטית (PLLA) ספינינג פתרון
- להמיס 0.4 גרם PLLA ב 9 מ"ל כלורופורם על ידי ערבוב על להבה נמוכה.
- הוסף 1 מ"ל dimethylformamide לפתרון, להביא את הריכוז הסופי של הפתרון PLLA 4% (w / v) ב כלורופורם: DMF 09:01 (v / v).
- מניחים את פתרון פוליפרופילן או מזרק זכוכית עם קצה מתכתי קהה 23ga.
2. ספינינג הכנת התשתית 1
- בצע פתרון 8% (w / v) של 85:15 PLGA (poly-לקטית, חומצה גליקולית שיתוף) ב כלורופורם על ידי ערבוב על להבה נמוכה.
- מעיל נקי זכוכית לכסות תלושי ב PLGA על ידי כיסוי פני השטח של כל תלוש לכסות את הפתרון PLGA. אפשר PLGA כדי לייבש את סרט דק (כ 30 דקות).
3. Electrospinning 2
- Secure לכסות PLGA זכוכית בפתקי לאספן עם הקלטת פחמן מוליך. עבור סיבים מיושר, אספן הוא גלגל ממונע. עבור סיבים אקראי, אספן היא צלחת נייח.
- המקום מזרק במשאבה עם טיפ 20 ס"מ גלגל אספן. הגדר משאבת מ"ל כ 2 / hr ואם באמצעות גלגל, להגדיר את המנוע על סל"ד 300-400. אם הדבר אפשרי, להחיל הטיה -2 kV DC לאספן ו 15 kV עד קצה מתכת. בהיעדר גישה אספקת חשמל דו קוטבית, הקרקע אספן.
- סיבים יהיה סילון מקצה המזרק ולאסוף על הגלגל מסתובב. המשך ספינינג עד הצפיפות הרצויה של סיבים מתקבל. תקחי את קצה מתכת עם מגבת נייר מודבקת מוט לא מוליך מעת לעת על מנת למנוע סתימת בקצה.
4. Moating 1
- בעקבות ספינינג, "החפיר" את דגימות electrospun pipetting על ידי שורה של PLGA מסביב של להחליק את המכסה. אפשר PLGA להתייבש. זה יהיה לשמור על היישור של סיבי במהלך התרבות.
5. חלבון ציפוי
- סיבים electrospun בקרות זכוכית צריך להיות מצופה בחלבון לפני תרבית תאים. מכסים את מצעים בתמיסה חלבון לפחות שעה אחת ולאחר מכן לשאוב פתרון עודף ולהמשיך aspirating עד מצעים יבשים. חלבון פתרונות אפשריים כוללים: PLL (poly-L-ליזין) (100 מיקרוגרם / מ"ל), laminin (25 מיקרוגרם / מ"ל), או פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מ"ל). אם PLL משמש, מצעים יש לשטוף במים סטריליים מיובשים פעמיים הבאים ציפוי הראשונית.
6. השג E15 עוברים עכברוש 3
* כל הניסויים נעשו בהתאם מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה כפי שאושר על ידי אוניברסיטת מישיגן ועדת שימוש וטיפול של בעלי חיים.
- אופן ההכנה: בדוק אם החיה היא בהריון. הפשירי 3 מ"ל טריפסין, 3 מ"ל FBS ובקבוק חם של L15. אש פולנית פיפטה פסטר. לחטא את כל מכשירי ניתוח באתנול 70% למשך 30 דקות.
- הכן וחם התקשורת ציפוי (ראה לוח 1).
- המתת חסד: ביצוע זריקת ה-IP של קטמין / xylazine. המתן 10-15 דקות לבדוק חוסר הקרנית דוושת רפלקסים נסיגה. לאחר רפלקסים נעדרים, לבצע זריקה של IC pentobarbital (FatalPlus).
- אוהל את העור של הבטן. חותכים דרך העור שכבות שריר לחשוף את חלל הבטן. אתר את הרחם לנתק אותו צוואר הרחם והשחלות.
- הסר את העוברים מן הרחם במספריים ולמקם אותם מיד לתוך L15 חם. (כל הנהלים הבאים הושלמו תחת מיקרוסקופ ועוברים לנתח וחוטי גזור צריך להיות שקוע L15 חמים בכל עת.) לערוף את העוברים על ידי סגירת מלקחיים סביב הסנטר ומתחת עצם העורפית של הגולגולת.
7. Dissection 3
- מניחים את העובר על צד אחד. הגנה על חוט השדרה עם קבוצה אחת של מלקחיים תוך שימוש בערכת אחרים לסלק את הגפיים אברי הבטן.
- הפעל את העובר ולהחזיק אותו יציב עם קבוצה אחת של מלקחיים. Snip לאורך העובר, מהצוואר עד לזנב, עד חוט כולו חשוף.
- תפוס את הקצה של החוט בזהירות למשוך אותו מעל עצמה לכיוון הזנב להסיר. כבל ימשוך חינם עם הממברנה הגרעינים השורש הגבי (DRG) מצורף.
- אם DRG explant או נוירון ניתק תרבות חושית יש לבצעם, לגזור את DRG חוט ולהעבירם מנה טרייה של L15 חם.
- עבור DRG תרבות explant, דלג לשלב 10.2
- במשך תרבות ניתק נוירון חושי, דלג לשלב 9
- במשך תרבות הנוירון המוטורי, DRG יוסר עם קרום בשלב 7.5
- הסר את הממברנה של חוט השדרה ידי אחיזה אותו בקצה העליון של חוט ומתקלף אותו, בדומה הסרת גרב ארוך. חזור על כל העוברים ואז קוצצים את מיתרי לתוך (2-3 מ"מ) לחתיכות קטנות.
- יוצקים את מיתרי קצוץ L15 לתוך חרוטי ספין על 1000 סל"ד במשך 2-3 דקות עד גלולה את השברים.
- יוצקים את supernatant ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין על מיתרי pelleted. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במים.
- הוסף 3 מ"ל FBS אל חרוטי ספין על 1000 סל"ד במשך 2-3 דקות מחדש גלולה.
- יוצקים את supernatant ומעיל אש מלוטש פיפטה פסטר עם FBS.
- מוסיפים פיפטה פסטר מלא של L15 ל חרוטי ואז triturate בעדינות עד הפתרון הוא אחיד ללא גושים נראים לעין. הימנע בועות.
- הכן פתרון 9% Optiprep ב L15. הכן קנה אחד עם 3 מ"ל של התמיסה Optiprep כל שני עוברים (אם יש מספר אי זוגי של עוברים, לאסוף).
- זרוק את פתרון הומוגני על הפתרון Optiprep, וחלוקתו באופן שווה בין כל הצינורות. ספין צינורות ב 2000 סל"ד במשך 15 דקות.
- בזהירות לאסוף את מ"ל העליון 2 מהצינור כל הבריכה בתוך 50 מ"ל חרוטי. ממלאים את חרוטי עם L15 ו ספין על 1000 סל"ד במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים של Optiprep.
- יוצקים את supernatant ו resuspend התאים כמות קטנה של התקשורת ציפוי (250-500 μl). ספירת התאים באמצעות הרחקה trypan כחול כדי לזהות תאים חיים. דלג לשלב 10.1
9. חושי Neuron (SN) עיבוד 7
- יוצקים את DRG להסיר את מיתרי השדרה L15 לתוך צינור ספין חרוטי ועל RPM 1000 דקות 2-3 על גלולה את השברים.
- יוצקים את supernatant ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין ל DRG pelleted. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במים.
- הוסף 3 מ"ל FBS אל חרוטי ספין על 1000 סל"ד במשך 2-3 דקות מחדש גלולה.
- יוצקים את supernatant ומעיל אש מלוטש פיפטה פסטר עם FBS.
- מוסיפים פיפטה פסטר מלא של L15 ל חרוטי ואז triturate בעדינות עד הפתרון הוא אחיד ללא גושים נראים לעין. הימנע בועות.
- ספין homogenate ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. יוצקים את supernatant ו resuspend התאים כמות קטנה של התקשורת SN ציפוי (250-500 μl). ספירת התאים באמצעות הרחקה trypan כחול כדי לזהות תאים חיים. המשך לשלב 10.1
10. ציפוי ותרבות
- עבור SN ניתק או MN תרבות:
- מכסים את מצעים עם כמה טיפות של התקשורת מכן להוסיף נפח מתאים של השעיה התא. תאים ניתק צריך להיות מצופה בצפיפות נמוכה (25-50 תאים / מ"מ 2). אפשר התאים לדבוק לפחות שעה אחת לפני מציפים את בארות עם התקשורת.
- עבור DRG תרבות explant:
- מכסים את מצעים עם כמה טיפות של התקשורת מכן להוסיף DRG לתקשורת. מסדרים את DRG ולכן הם מופצים באופן שווה על פני המצע (כ 4 DRG יתאים תלוש 22x22 מ"מ לכסות). אפשר DRG לדבוק לפחות 4 שעות לפני מציפים את בארות עם התקשורת.
- תרבויות יכול להישמר לתקופה של עד 4 ימים ללא שינוי התקשורת. עבור תרבויות יותר, חצי שינויים התקשורת צריך להיעשות עם התקשורת להאכיל. ערוצי המדיה הרכב זהה התקשורת ציפוי מינוס L-גלוטמין.
11. Immunocytochemistry 1,5,8
- תיקון תאים: התקשורת לשאוב ולהחליף PFA 4% חם (paraformaldehyde) למשך 30 דקות. ואז לבצע 3X 5 דקות 1x שוטף PBS.
- חסימת / permeabilization: הכן לחסום / סלסול פתרון (1.25% בסרום שור אלבומין 1X PBS, 0.05% Triton X-100 ו - 2.0% בדם עזים רגיל). PBS לשאוב וליישם לחסום / סלסול פתרון דגימות במשך 30 דקות. ואז לבצע 1X 5 דקות 1x שוטף PBS.
- נוגדן ראשוני: הכן פתרון נוגדן ראשוני עובדים (10% נסיוב עז נורמלי, 1.25% שור סרום אלבומין, 0.1% Na אזיד, 0.05% Triton X-100 ו 10 מ"ל עם 1x PBS). הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (ראה טבלה 2). מספר מנות קו עם parafilm. המקום חרוז 200μl של פתרון נוגדן ראשוני על parafilm עבור כל המצע. היפוך מצעים, צפים להם בצד התא על הפתרון נוגדן ראשוני לעבוד לילה (אם החדר ממוזג או יבש במיוחד, פיסת נייר רווי מים ניתן להוסיף לפינה של המנה על מנת למנוע אידוי של הפתרון עובד) .
- נוגדנים משני: הסר את מצעים מן הראשית (הפתרון עובד ניתן לאסוף, לאחסן ב 4 ° C ולעשות בהם שימוש חוזר) ולבצע 2X 5 דקות 1x שוטף PBS. החל משני הנוגדנים 200 μl מדולל 1:200 ב PBS (הפוכה גם על צלחת מרופדת parafilm) במשך 4 שעות.
- הסר משני ולאחר מכן לבצע 2X 5 דקות 1x שוטף PBS. מצעים הר בשקופיות עם להאריך זהב המכיל DAPI או אחרת נגד הגרעין מתאים הכתם.
12. נציג תוצאות:
מורפולוגיה אופיינית בציר אקראי אלסיבים ectrospun מוצגים באיור 1. אנחנו בדרך כלל להשיג טוהר MN של> 90% נוירונים 7,8 עם פרוטוקול זה ויש לנו לשמור DRG תרבויות במשך שבוע כל עוד פיברובלסטים ללא צמיחה משמעותי. איור 2 מראה אופייני המראה MN על זכוכית וסיבי לאחר 24 שעות של תרבות immunostaining. DRG Immunostained בתרבית במשך שלושה ימים על זכוכית וסיבי מתוארים באיור 3.
1. איור יישור סיבים היא מניפולציה על ידי בחירה של אספן. א) מזדהות סיבים סובב על אספן גלגל מסתובב ב) סיבים אקראי הסתובב על אספן צלחת נייח. ברים סולם = 20 מיקרומטר.
איור 2. נוירונים נציג מנוע מוכתם עבור TuJ1 (ירוק) ו DAPI (כחול) לאחר 24 שעות של תרבות על א מצופה PLL) סיבי ו-B) זכוכית. ברים סולם = 20 מיקרומטר.
איור 3. DRG נציג מוכתם עבור neurofilament (ירוק) לאחר 3 ימים של תרבות על א מצופה PLL) זכוכית ב) סיבים. ברים סולם = 200 מיקרומטר.
| במלאי פתרון: | MN התקשורת: | DRG / SN התקשורת: |
| 10 מ"ג למ"ל -1 אלבומין | 12.5 μl | - |
| 10 מ"ג למ"ל -1 apo-transferrin | 50 μl | 40 μl |
| 50 מיקרוגרם למ"ל -1 β-estradiol | 2.7 μl | 2.2 μl |
| 0.1 מ"ג למ"ל -1 ביוטין | 50 μl | - |
| 16 מ"ג למ"ל -1 Catalase | Μl 8 | - |
| 15 מ"ג למ"ל -1 D-גלקטוז | 50 μl | - |
| 50 מיקרוגרם למ"ל -1 הידרוקורטיזון | 3.7 μl | 2.9 μl |
| 0.63 מ"ג למ"ל פרוגסטרון -1 | 0.5 μl | - |
| 16 מ"ג למ"ל -1 putrescine | 50 μl | - |
| 50 מ"ל מיקרוגרם סלניום -1 | 3.4 μl | 4.1 μl |
| 2.5 מ"ג למ"ל -1 superoxide dismutase | 50 μl | - |
| * 500 ננוגרם למ"ל עצב גורם גדילה -1 | - | 1 מ"ל |
| * 100x PSN | 0.5 מ"ל | 0.5 מ"ל |
| * B27 | 1 מ"ל | 1 מ"ל |
| * 2 מ"מ L-גלוטמין | 35 μl | 35 μl |
| * Neurobasal | עד 50 מ"ל | עד 50 מ"ל |
טבלה 1. הוסף כיכב (*) רכיבי התקשורת רק לפני השימוש. הרכיבים הנותרים אפשר להכין כפתרון מניות והמשיך ב -20 ° C עד הצורך 6,7.
| ראשי (ריכוז) | נוירונים: | גליה: | Fibroblasts: |
| אנטי-β טובולין (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| אנטי neurofilament (1:1000) | ✓ | X | X |
| אנטי S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| אנטי NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
טבלה 2. הבחירה של הנוגדן העיקרי תלוי המטרות של החוקר. האמור לעיל הם נוגדנים כמה ריכוזי השתמשנו בהצלחה במעבדה שלנו. S-100 הוא שימושי במיוחד כדי לזהות תאים שוואן ו / או לבדוק זיהום fibroblasts, אבל שים לב כי זה חייב להיות בשילוב עם NGFR p75 להבחין בין גליה ו fibroblasts4. שמנו לב גם כי NGFR p75 כתמים neurites מאוד קלות בעוד neurofilament או TuJ1 הם בחירה מעולה אם המטרה היא להמחיש neurites בודדים.
Discussion
בפרוטוקול זה יש כמה שלבים קריטיים. הראשונה כוללת את הייצור התקין של מצעים סיבים electrospun. בתקשורת נוזלי, סיבי PLLA, PLGA הסרט החפיר PLGA יהיה נפרד מן להחליק את מכסה זכוכית כיחידה אחת. אם PLGA מושמט, סיבים PLLA לא תישאר גיליון שטוח - הם יוכלו להתכרבל לתוך סבך שמיש. לכן, הסרט PLGA כלול מצע מתאים כדי לשמור על יישור סיבים במהלך התרבות. החפיר הוא הוסיף לאחר ספינינג הן כדי להבטיח את הסיבים מקובעים היטב בסרט PLGA כדי להוסיף קשיחות מבנית לסרט. החפיר משמש גם ידית שימושי כאשר הם מניפולציה מצעים במהלך תיקון, צביעה ו - גובר. טחינה דקה היא השלב הקריטי השני. כל מאמץ צריך להיעשות כדי למנוע היווצרות של בועות. בנוסף, השגנו תשואה גבוהה הרבה יותר כאשר פיפטה אש מלוטש משמש בשלב זה. כדי ללטש אש, אור צורב בונזן ולצרף נורה אל פיפטה. לעבור את קצה פיפטה במהירות דרך הלהבה 2-3 פעמים ברציפות תוך לוחץ ומשחרר את הנורה - זרימת אוויר דרך פיפטה תסייע למנוע את קצה מסגירת לחלוטין. בדוק את קצה פיפטה כדי להבטיח החור עדיין פתוח וכי קצוות מעוגלים מופיעים מעט לפני השימוש.
Electrospinning זהו תהליך מאוד תכליתי, את הפרמטרים electrospinning יכול להיות שונה כדי לייצר סיבים עם מגוון רחב של מורפולוגיות. טאן et al. (2005) פרטי לימוד שיטתי של פרמטרים המשפיעים על קוטר של סיבים PLLA electrospun. וואנג et al. (2009) מציג מחקר מפורט של הפרמטרים המשפיעים על מערך של סיבים electrospun PLLA.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
