Summary
Este protocolo descreve a preparação de um substrato sintético para o tRNA
Abstract
Protozoários estão entre os agentes infecciosos mais devastador dos seres humanos responsáveis por uma variedade de doenças como amebíase, que é uma das três causas mais comuns de morte por doenças parasitárias. O agente de amebíase é a ameba Entamoeba histolytica parasita que existe em duas etapas: o cisto infecciosa encontrada em alimentos ou água e os vivos trofozoíto invasivos no intestino. As manifestações clínicas da amebíase gama de ser assintomática a abscessos disenteria, colite ou fígado. E. histolytica é um dos raros parasitas unicelulares com 5-metilcitosina (5mC) em seu genoma. 1, 2 Ela contém uma única DNA metiltransferase, Ehmeth, que pertence à família Dnmt2. duas Um papel para Dnmt2 no controle de elementos repetitivos tem foram estabelecidas em E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 e Drosophila. 6 Nosso trabalho recente mostrou que Ehmeth methylates tRNA Asp, e este achado indica que esta enzima tem um DNA dual / tRNA Asp atividade metiltransferase. 7 Esta observação está de acordo com a atividade dupla que tem sido relatada por D. discoideum e D. melanogaster. 8 O significado funcional da especificidade DNA / tRNA de Dnmt2 enzimas ainda é desconhecida. Para abordar esta questão, um método para determinar a atividade metiltransferase tRNA de Dnmt2 proteínas foi estabelecida. Neste vídeo, descrevemos uma abordagem simples de preparar um substrato adequado para tRNA Dnmt2 e um método para medir sua atividade metiltransferase tRNA.
Protocol
Pré-requisito antes de iniciar o experimento:
- RNase água é utilizada na manipulação de RNA no laboratório para reduzir o risco de ser degradado por RNA RNases. Para este fim, a água é normalmente tratada com 0,1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) por pelo menos 1 hora a 37 ° C e então autoclavado (pelo menos 15 min) para inativar os traços de DEPC.
- Pipetas Pipetman são limpos com uma solução de descontaminação RNase (RNase exterminador, Biological Industry Beit HaEmek) antes do uso.
- Tubos Eppendorf e dicas deve ser certificado como livre de DNase e RNase para preservar a integridade da amostra.
1. tRNA Asp Preparação
Este procedimento descreve uma transcrição in vitro run-off que pode ser utilizado para a síntese de qualquer tRNA. Este procedimento é uma adaptação do método ribozima publicado anteriormente. 9 Para este efeito, um modelo foi projetado consistindo do promotor T7 e as seqüências complementares de uma auto-clivagem martelo ribozima eo tRNA necessário. Transcrição deste modelo de resultados em um produto de clivagem-se no 5 `-end de uma forma que o tRNA full-length é obtido com a 5`-OH em vez de um fosforilada 5 `-end. O tRNA full-length pode ser purificado a partir clivada martelo ribozima e produtos uncleaved por uréia-PAGE.
- PCR Primer e Design Template:
A fim de obter um modelo eficiente para T7 RNA polimerase, mediada transcrição in vitro três requisitos devem ser cumpridos.- A sequência de promotor T7 (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) tem de estar implicada no modelo.
- Para aumentar a eficiência de transcrição, os três primeiros nucleotídeos do RNA transcrito deve ser guanosina.
- A seqüência correta complementares do tRNA específico é necessário.
- PCR
Para a amplificação de DNA modelo, foi utilizada uma reação de PCR padrão em um volume final de 50 mL. A Tabela 1 detalha as concentrações final (reação preparado em gelo) e um programa para a PCR. A baixa temperatura de recozimento usado durante a fase inicial 10 contas de ciclos para a ligação apenas parcial do primer para a frente para o modelo de DNA. Para reduzir a temperatura de ligação inespecífica annealing foi aumentada para mais 25 ciclos de amplificação.
O sucesso da amplificação do modelo foi testado por um gel de agarose 1,3% com prestained 1X solução GelRed (Figura 2). - Transcrição
- Premix T7 pode ser preparado concentrado de 5X (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, 1 espermidina mM, 5 mM DTT, 2 mg / mL BSA e 0,01% Triton X-100) e foi usado por pelo menos um semana ou cinco ciclos de degelo congelar.
- A mistura de transcrição tem que ser preparado à temperatura ambiente.
- Reações de transcrição foram preparadas com 80 premix T7 mL, 80 mL do produto da PCR, 80 mix NTP mL (25 mM) e ajustada para 385 mL com água MilliQ. 15 mL (1,34 mg / mL) T7 RNA polimerase (concentração final 0,05 mcg / mL) são adicionados para iniciar a reação.
- A reação foi realizada por 4 h, a 37 ° C. O precipitado branco indica a transcrição de pirofosfato de sucesso.
- Purificação
- Pirofosfato foi girado para baixo por 1 minuto a 10.000 rpm.
- Sobrenadantes foram fornecidos com um volume de carga formamid corante e purificada em um 12% de uréia-PAGE utilizando20 W por 2 horas. Desmontar o gel e coloque-o saran wrap.
- Manchar o gel com solução 3XGelRed suplementado com NaCl 0,1 M por 20 minutos. Após a excitação UV rótulo, a banda tRNA sobre o envoltório de saran com um marcador permanente para a excisão mais tarde. Alternativamente, se o rendimento esperado é acima de 50 mg bandas pode ser visto por UV-sombreamento. Para UV-shadowing, coloque o gel em uma placa de cromatografia em camada delgada fluorescentes e iluminar com um UV-mão lâmpada de cima. Bandas de etiqueta, que aparecem como não-fluorescentes sombras no gel (Figura 3), para excisão mais tarde.
- bandas tRNA foram excisadas com um bisturi e colocados em copos de 1,5 mL Eppendorf.
- Após a adição de 450 mL de NH 4 OAc 0,5 M as amostras são congeladas a -80 ° C por 2 horas e depois incubadas a 20 ° C, agitando com 550 rpm em um Thermoshaker Eppendorf durante a noite. 6. O sobrenadante NH 4 OAc soluções a partir da etapa 5 são filtradas com Nanosep tubos (0,45 mm), girando 90 segundos a 8.500 rpm para remover detritos PAGE.
- Precipitação de tRNAs eluída foi realizada pela adição de 2,5 volumes de -80 ° C etanol puro (pa), o armazenamento a -20 ° C durante a noite e 2,5 h centrifugação a 4 ° C e 15.500 rpm.
- Após a remoção do sobrenadante pellets foram secas em SpeedVac e ressuspenso em água MilliQ.
- As concentrações foram determinadas usando um Nanodrop ND1000. O rendimento de uma transcrição 400 mL foi de cerca de 8-10 mg.
Solução de problemas:
- Nenhum produto da PCR. → É a seqüência de primers e modelo compatível e todos os componentes dentro da mistura de reação?
- Nenhum produto de transcrição. → PCR poderia ter sido vencida. T7 promoter seqüência correta. Soluções muito frio enquanto se prepara a reação. T7 Premix muito velho.
- Produto no gel, mas nenhum produto eluído. → O etanol para a precipitação não frio o suficiente, não puro, não o volume correto.
2. Expressão e purificação da E. recombinante histolytica Dnmt2 Protein (Ehmeth) em E. coli BL21
Este protocolo também é adequado para a preparação de Dnmt2 proteínas de humano 10 e Drosophila 11.
- O E. histolytica Ehmeth gene foi amplificado por PCR, clonados em pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificadas com o seqüenciamento
- O plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli (BL21) para a expressão de proteínas recombinantes.
- Bactérias transformadas foram selecionadas em Luria-Bertani (LB) ágar ampicilina médio (100 mcg / mL). Quatro a cinco colônias foram apanhados e inoculadas em 5 mL de mídia LB com marcador seletivo adequado (100 mcg / mL ampicilina) e incubadas durante a noite em um agitador orbital a 37 ° C.
- A cultura cresceu durante a noite foi inoculado em 500 mL de extrato de levedura 2X Triptona médio (2XYT) com 100 mcg / mL ampicilina e incubado em um agitador orbital a 37 ° C até o OD 600 da cultura atingiu 0,8.
- A expressão da proteína recombinante foi induzida Dnmt2 adicionando isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) em uma concentração final de 0,5 mM para a cultura. A cultura foi ainda incubado em um agitador orbital por 16 horas a 24 ° C. O tempo ea temperatura de incubação foram otimizados para evitar a formação de corpos de inclusão.
- A cultura foi centrifugado a 4 ° C, 6.000 rpm, em 200 mL Nalgene tubos por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado eo pellet foi congelado a -70 ° C durante pelo menos 1 hora. Esta etapa de congelamento melhora a lise das bactérias.
- O pellet foi colhida em 30 mL de tampão de lise (100 mM KCl, 1 mM DTT, 1mM PMSF, 100 mcg / mL e lisozima Leupeptine 100 mcg / mL em tampão fosfato salina (PBS)). A partir deste ponto, foi crucial para manter o lisado no gelo para evitar a inativação da proteína recombinante. O lisado foi sonicado em um banho de água gelada na configuração não. 4 de um MSE (Londres, Reino Unido) sonifier (alta potência, amplitude 5, 30 pulso segundos, 30 segundos de descanso por 5 minutos). DNA de bactérias que podem estar associadas à Ehmeth foi removida com Benzonase Nuclease tratamento (Novagen) (5 U / mL de lisado sonicado), por 30 minutos no gelo. Lise foi completado pela adição de 300 mL de reagente de extração da proteína BugBuster (Novagen) por 30 minutos em temperatura de 4 ° C com agitação suave em um agitador orbital (100 rpm).
- A proteína recombinante GST-Ehmeth foi purificada em condições nativas em uma resina de glutationa-agarose acordo com as instruções fabrica (Sigma). Para 25 mL de lisado, 500 mL de resina, polpa foram adicionados e incubados a 24 ° C por 1 hora.
- As pérolas foram lavadas duas vezes com tampão de lise (10 volumes de tampão de lise por volume de contas) e 6 vezes com PBS frio. Estas etapas de lavagem extensa assegurar que não havia de permanecer Benzonase antes da elution passo.
- Proteína recombinante Ehmeth foi eluída da glutationa contas agarose incubando a contas com 5 mL de glutationa tampão de eluição (Tris HCl 50 mM pH 8,0, glutationa (Sigma) 10 mM) por 12 horas a 4 ° C com rotação suave. As contas foram removidas por centrifugação (2.000 rpm, 5 minutos) eo sobrenadante foi coletado.
- O buffer de eluição no sobrenadante foi substituído por um buffer de armazenamento (KCl 200 mM, EDTA 10 mM, 0,1 mM DTT, Glicerol 60% em PBS). Para esta finalidade, 5 mL do sobrenadante foi carregado no topo um microcontrolador Millipore YM-30 centrífuga dispositivos de filtro (30 kDa cortado coluna) e centrifugado a 8.000 rpm por 20 minutos a 4 ° C. A proteína concentrado foi diluído em tampão de armazenamento (5 mL) e recarregados no dispositivo do filtro. O mesmo procedimento deve ser repetido pelo menos 3 vezes para garantir a substituição completa do tampão de eluição pelo buffer de armazenamento. Finalmente a proteína concentrada deve ser diluída em cerca de 300 mL de tampão de armazenamento.
- A concentração da proteína recombinante foi medida por um ensaio de proteína Bradford. A preparação da enzima recombinante foi armazenado a -20 ° C. Concentração final da enzima não deve ser inferior a 3 mg / mL como uma concentração adequada para o ensaio de metilação.
- A preparação de proteína foi verificada por SDS-PAGE.
Aviso: para garantir a preparação de uma enzima ativa, todas as etapas de purificação deve ser feito em gelo e TDT deve ser preparada e adicionada ao buffer de armazenamento. Isto garante uma enzima ativa por 6 meses.
3. In vitro Metilação TRNA
Soluções e reagentes que deve estar preparado:
- Solução 1 M de tris (hidroximetil) aminometano. Ajustar o pH da solução para 8,0 com ácido clorídrico concentrado (HCl).
- Buffer de metilação 5X (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100mM NH 4 OAc, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. O MB pode ser preparado com antecedência e armazenado a -20 ° C sem ditiotreitol (DTT).
- Prepare o unlabeled S-adenosilmetionina ações (AdoMet) (final de concentração 1,5 mM), misturando 5 mL AdoMet (New England Biolabs, 32 mM de concentração), com 101,67 mL de água destilada.
- Solução de ácido tricloroacético 5% (TCA)
- O etanol 100%
- De cintilação líquida de 3 mL por frasco da amostra.
O ensaio:
- Um esquema de pipetagem está preparado (Tabela 2) para um volume de 40 mL final do ensaio de metilação.
- Em um tubo Eppendorf de 1,5 mL, tRNA foi diluído com água tratada DEPC para uma concentração final de 5 mM (1μg tRNA é equivalente a 40 pmol)
- 4 mL da TDT foi adicionado (concentração da solução-mãe) para 8 mL de solução 5XMB.
- A solução tRNA foi incubada a 85 ° C por 2 minutos e a solução preparada na Etapa 3 foi adicionado imediatamente a ele. A mistura foi permitido para esfriar em temperatura ambiente por 15 minutos para deixar o fold tRNA corretamente.
- A mistura AdoMet (concentração final 200 mM) foi preparada pela mistura de 50 mM de AdoMet rotulada (250 μCi, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) com 150 mM de AdoMet sem rótulo. Para um mix adequado para AdoMet 10 reacções rotulagem, que misturados 5,2 mL de unlabeled AdoMet (a partir da solução diluída), 29 mL de AdoMet rotulados e 5,8 l de água destilada.
- 4 mL da mistura preparada AdoMet acima foi adicionado à solução de tRNA e incubadas por 2 minutos a 37 ° C.
- O tRNA metiltransferase, Ehmeth (concentração mM 10/01 final) foi adicionado à solução contendo o substrato tRNA e os rotulados-unlabeled cofactor AdoMet. A mistura foi incubada por 3 horas a 37 ° C. Os tubos foram misturados regularmente durante o tempo da incubação suavemente lançando-los. A curva cinética da reação enzimática foi construído tomando a cada 20 minutos uma amostra (8 mL) a partir da mistura de reação durante um período de três horas.
- Cada amostra foi imediatamente viu no centro de um filtro Whatman (0,5 cm de diâmetro) eo filtro foi embebido em uma solução a 5% TCA e agitado no gelo por 10 minutos (exceto para a amostra AdoMet, Tabela E Coluna 2 que não deve ser lavado). A etapa de lavagem com 5% de solução de TCA foi repetido mais duas vezes
- O filtro foi lavado com etanol 100% no gelo por 10 minutos.
- O filtro foi seco ao ar por um mínimo de 20 minutos.
- Cada filtro seco foi colocado em um tubo (especificação) que anteriormente era preenchido com 3 mL de líquido de cintilação (CytoScint)
- A radioatividade incorporada no tRNA estava usando um contador de cintilação (Counter Beta Tri-Carb 2100TR).
4. Solução de problemas
- Altos valores na coluna A ou B (Tabela 3), os valores das amostras de controle foram semelhantes aos esperados a partir da reação de metilação na coluna C ou D (Tabela 3) → os filtros não foram lavadas corretamente.
- Baixos valores na coluna C ou D (Tabela 3), os experimentos de metilação apresentou valores semelhantes à reação de controle na coluna A ou B (Tabela 3) → a enzima não foi preparado corretamente, o que significa que não houve incorporação Adomet. Outra opção é que o tRNA foi degradado e não foi um substrato adequado para a enzima, isso pode ser verificado rodando a amostra tRNA em um gel de acrilamida uréia (ver 1.2) e coloração do gel com brometo de etídio para examinar a integridade do tRNA .
- Baixos valores na coluna D (Tabela 3) → uma vez que a atividade de Ehmeth é mais fraco, em seguida, o desempenho do hDnmt2 enzima pode ser melhorada através do aumento da concentração de DTT no buffer de armazenamento (pode variar entre 1-10 mM) ou para aumentar a concentração de enzima para atenuar a má qualidade da enzima.
- Baixos valores na coluna E (Tabela 3) → esta coluna representa a radioatividade total do valor AdoMet rotulada (referido como 100%), se o valor nesta coluna é baixa, significa que o AdoMet não está mais ativo e perdeu o seu radioatividade.
5. Resultados representante
| Reagente | Concentração Final | PCR - Programa de | |||||
| Gentherm PCR buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3,0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP mix | 1,2 mM | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| DNA modelo | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Primer para a frente | 3,0 mM | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Primer reverso | 3,0 mM | 2.-4. 10 ciclos | 5.-7. 25 ciclos | ||||
| Polimerase Taq | 0,1 U / mL | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Ad 50 ul | tampa 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabela 1: Pipete esquema para PCR e PCR programa.
| A Controle negativo (Ehmeth apenas) | B Controle negativo (TRNA apenas) | C Controle positivo com Dnmt2 humana | D Reação padrão (Enz + + SUBST Cof) | E Valor total da AdoMet no filtro | |
| tRNA | - | (3 mg) | (3 mg) | (3 mg) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 mg) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 mg) | (2,48 mg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| TDT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Total | 40 mL | 40 mL | 40 mL | 40 mL | 1 mL |
Tabela 2:. Exemplo de esquema de pipetagem Cada coluna no esquema representa uma amostra.
* Ambos Ehmeth e hDnmt2 foram fundidos em um tag GST com um tamanho estimado de proteína de 62 kDa.
A-Negativo de controle que inclui apenas Ehmeth.
B-Negativas de controle que inclui apenas tRNA.
C-Positivas controle com Dnmt2 humana. Esta enzima tem atividade dez vezes mais do que Ehmeth
D-Standard reação que inclui a enzima, o substrato eo cofator
E-Total valor do AdoMet no filtro. Esse valor é usado para o cálculo do percentual de grupo metil incorporadas.
| A Controle negativo (Ehmeth apenas) | B Controle negativo (TRNA apenas) | C Controle positivo com Dnmt2 humana | D Reação padrão (Enz + + SUBST Cof) | E Valor total da AdoMet no filtro | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tabela 3:. Exemplo de valores lidos pelo contador de cintilação Cada coluna no esquema representa uma amostra da Tabela 1.
Figura 1: (A) T7 modelo de transcrição e primers para transcrição in vitro. Todas as seqüências são escritas em 5 'para 3' orientação. ColorCode: veja o texto. (B) Esquema da formação do produto durante a transcrição. A transcrição do RNA é sintetizada pela T7 RNA polimerase. Hammerhead ribozima e tRNA vezes em seus respectivos 2D-estruturas e da ribozima cliva-se do tRNA sair de um grupo hidroxila em sua extremidade 5'-(adaptado de 9).
Figura 2:. PCR controle de reação em um gel de agarose 1,3% com prestained 1X reações GelRed PCR em dois modelos diferentes são mostradas ao lado de 100 pares de bases mais escada. Controles incluem um "modelo único" lane e reações em que o primer reverso foi omitido.
Figura 3:. Sombreamento UV-A separação PAGE de duas misturas de transcrição é mostrado. Bandas de transcrições precursor (antes de clivagem), comprimento total tRNA e martelo ribozima tornam-se visíveis como sombras, uma vez que evitar que a luz UV que chega até a placa de TLC fluorescente. TRNA total de E. coli é usada como marcador de tamanho.
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Discussion
Nesta apresentação, ilustramos como preparar componentes ativos para a medida da atividade metiltransferase tRNA de E. histolytica enzima Ehmeth. Este procedimento pode servir como um ponto de partida e ser facilmente adaptado para a medida de metiltransferases tRNA outros. É importante seguir os procedimentos que preservem a qualidade ea integridade do substrato tRNA e da proteína tRNA metiltransferase para garantir uma medida óptima da atividade enzimática.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por concessões do Ciência Israel Foundation e do Instituto da Família Rappaport de Pesquisas de Ciências Médicas e da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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