Summary
Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat açıklar
Abstract
Protozoa parazitler amebiasis, paraziter hastalık ölüm üç en yaygın nedenlerinden biri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların sorumlu insanların en yıkıcı enfeksiyöz ajanlar arasında yer almaktadır. Amebiyazis ajan iki aşamada altında var olan amip parazit Entamoeba histolytica: enfektif kisti, bağırsak gıda ya da su ve invaziv trophozoite yaşam bulundu . Asemptomatik kolit, dizanteri veya karaciğer abseleri amebiasis aralığının klinik bulgular E. histolytica nadir tek hücreli parazitin biri kendi genom 5-methylcytosine (5MC) ile 1, 2 Dnmt2 ailesine ait metiltransferaz tek bir DNA Ehmeth, içerir. 2 tekrarlayan elemanlarla kontrol Dnmt2 bir rol E. kurulmuştur histolytica, 3 Diktiyostelyum diskodeyum 4,5 ve Drosophila 6 Bizim son iş bu Ehmeth metiller tRNA Asp gösterdi ve bu bulgu, bu enzim bir çift DNA / tRNA Asp metiltransferaz aktivitesi olduğunu göstermektedir. 7 Bu gözlem çift aktivite ile anlaşma D. bildirilmiştir diskodeyum ve D. melanogaster. Dnmt2 enzimler DNA / tRNA özgüllüğü 8 fonksiyonel önemi hala bilinmiyor. Bu soruya cevap için, Dnmt2 proteinler tRNA metiltransferaz etkinliğini belirlemek için bir yöntem kurulmuştur. Bu video, Dnmt2 için yeterli bir tRNA substrat hazırlamak için basit bir yaklaşımdır ve tRNA metiltransferaz aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
Deney başlamadan önce Önkoşul:
- RNaz içermeyen su RNA RNases tarafından bozulmuş olma riskini azaltmak için laboratuvarda RNA alınmasında kullanılır. Bu amaçla, su genellikle 37 en az 1 saat için 0.1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) ile tedavi edilir ° C ve daha sonra DEPC izleri inaktive etmek için otoklava (en az 15 dk).
- Pipetman pipetler kullanmadan önce bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu (RNaz Exterminator, Biyolojik Sanayi Beit Haemek) ile temizlenir.
- Eppendorf tüpleri ve ipuçları DNaz ve RNaz örnek bütünlüğünü korumak için ücretsiz sertifikalı olmalıdır.
1. tRNA Asp Hazırlık
Bu prosedür, herhangi bir tRNA sentezi için kullanılan in vitro run-off transkripsiyon bir açıklar . Bu prosedür, daha önce yayınlanmış ribozim yönteminin bir uyarlamasıdır. T7 organizatörü ve kendi kendine yarma çekiç ribozim ve gerekli tRNA tamamlayıcı dizileri oluşan bir şablon, bu amaçla 9. Transkripsiyon bir ürün bu şablon sonuçlarının tam uzunlukta tRNA ile elde edilir bir şekilde 5 `sonu kendini yarma 5`-OH yerine fosforile 5 `sonu. Tam uzunlukta tRNA üre-PAGE ile bölünmüş çekiç ribozim ve uncleaved ürünleri arınmış olabilir.
- PCR Primer ve Şablon Tasarımı:
T7 RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyon için etkili bir şablon elde etmek için üç gereksinimleri yerine getirilmesi gerekir.- T7 promotor dizisinde (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) şablonu karışmış olması gerekir.
- Transkripsiyon etkinliğini artırmak için, ilk üç nükleotidler transkripsiyonu RNA guanozin olmalıdır.
- Özel tRNA doğru tamamlayıcı dizisi gereklidir.
- PCR
DNA amplifikasyonu için, biz 50 mcL nihai hacmi standart PCR reaksiyonu kullanılır. Tablo 1 final konsantrasyonları (reaksiyon buz üzerinde hazırlanan) ve PCR için program. DNA şablon ileri astar sadece kısmi bağlanma için ilk 10 döngüleri hesapları sırasında kullanılan düşük tavlama sıcaklığı. Tavlama sıcaklığı bağlayıcı belirsiz azaltmak için daha 25 amplifikasyon döngüsü için çıkarılmıştır.
% 1.3 agaroz jel 1X GelRed çözüm (Şekil 2) ile prestained şablon amplifikasyon başarı ile test edildi. - Transkripsiyon
- T7 premix hazırlanmış olabilir 5X konsantre (200 mM Tris-HCl, pH 8.1, 30 mM MgCl 2, 1 mM spermidin, 5 mM DTT, 2 mcg / ml BSA ve% 0.01 Triton X-100) ve en az biri için kullanılan hafta ya da beş donma çözülme döngüleri.
- Transkripsiyon karışımı oda sıcaklığında hazırlıklı olmak zorundadır.
- Transkripsiyon reaksiyonlar 80 mcL T7 premix, 80 mcL PCR ürünü, 80 mcL NTP karışımı (25 mM) kullanılarak hazırlanmış ve MilliQ su ile 385 mcL ayarlanabilir. Reaksiyon başlatmak için 15 mcL T7 RNA Polimeraz (0.05 mcg / ml son konsantrasyon) (1.34 mg / ml) eklenir.
- Reaksiyon 37 ° C de 4 saat süreyle gerçekleştirildi Pirofosfat beyaz çökelti başarılı transkripsiyon gösterir.
- Arıtma
- Pirofosfat 10.000 rpm az 1 dakika aşağı doğru bükülmüş.
- Süpernatantlar bir hacim formamid boya yükleme ve% 12 üre-PAGE üzerinde saflaştırılmış ile birlikte2 saat boyunca 20 W. Jel ayırın ve Saran wrap üzerine yerleştirin.
- 20 dakika boyunca 0,1 M NaCl ile desteklenmiş 3XGelRed çözümü ile jel Leke. UV uyarma üzerine, etiket, daha sonra eksizyon için kalıcı bir kalem ile Saran wrap tRNA bant. Alternatif olarak, 50 mg bantları üzerinde beklenen verimi ise UV-gölgeleme tarafından görülebilir. UV-gölgeleme, floresan ince tabaka kromatografi plağının jel yerleştirin ve yukarıdan bir UV el lambası ile aydınlatmak. Daha sonra eksizyon için jel floresan olmayan gölgeler (Şekil 3), olarak görünür Etiket bantları.
- tRNA bantları bir bistüri ile eksize ve 1.5 ml Eppendorf bardak içine konuldu.
- 0,5 M NH 4 oac örnekleri 450 mcL eklenmesinden sonra -80 donmuş ° C 2 saat boyunca ve sonrasında 20 inkübe ° C, gece boyunca bir Eppendorf Thermoshaker 550 rpm sallayarak. 6. 5. adımdan itibaren Süpernatant NH 4 oac çözümler SAYFA enkaz kaldırmak için 8500 rpm'de 90 saniye iplik, Nanosep tüpleri (0.45 mm) ile filtrelenir.
- Yıkandı, tRNAs Yağış 2.5 -80 hacimleri ° -20 C'de saf etanol (pa), depolama ° C, 4 gecelik ve 2.5 saat santrifüj ° C ve 15.500 rpm. Ekleyerek yapıldı
- Çıkardıktan sonra supernatant pelet bir SpeedVac kurutulur ve MilliQ su ile yeniden süspanse.
- Konsantrasyonları Nanodrop ND1000 kullanılarak tespit edildi. 400 mcL transkripsiyon verimi yaklaşık 80-100 mikrogram oldu.
Sorun Giderme:
- PCR ürünü yok. → astar ve uyumlu şablon dizi var ve tüm bileşenler reaksiyon karışımı içinde?
- Transkripsiyon ürün yok. → PCR başarısız olmuş olabilir. Doğru T7 promotor dizisinde. Reaksiyon hazırlarken çok soğuk Çözümler. Çok eski T7 karışımlar.
- Ürün jel, ancak herhangi bir kolonda sürüklenecektir ürün. Saf olmayan, yeterli yağış için → Etanol soğuk değil, doğru hacimli değil.
2. Rekombinant E. İfade ve Saflaştırılması E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Protein coli BL21
Bu protokol, insan 10 ve Drosophila Dnmt2 proteinlerin hazırlanması için de uygundur. 11
- E. histolytica Ehmeth geninin PCR ile amplifiye pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) klonlanmış ve sıralama ile doğrulanmış oldu
- Rekombinant plazmid E. dönüştü rekombinant proteinler ifade coli (BL21).
- Dönüştürülmüş bakteri Luria-Bertani agar ampisilin (100 mg / ml), orta (LB) seçilmiştir. Dört-beş koloniye aldı ve 5 ml LB medya inoküle uygun seçici belirteç ile (100 mg / ml ampisilin) ve 37 orbital çalkalayıcı gece inkübe edildi ° C
- Gecede yetiştirilen kültür 2X Maya Özü Tripton (2XYT) orta içine 500 ml, 100 mg / ml ampisilin ile inoküle ve 37 orbital çalkalayıcı inkübe ° C kültür OD 600 kadar 0.8 ' e ulaşmıştır.
- Dnmt2 rekombinant protein ifade kültüre nihai konsantrasyonu 0.5 mM izopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ekleyerek neden oldu. Kültürü daha fazla, 24 ° C'de 16 saat süreyle orbital çalkalayıcı inkübe edildi Inkübasyon süresi ve sıcaklığı dahil organlarının oluşumunu önlemek için optimize edilmiştir.
- 4 kültür santrifüj edildi ° C, 6000 rpm, 15 dakika boyunca, 200 ml Nalgene tüpler. Süpernatant atılır ve pelet en az 1 saat -70 ° C'de donduruldu. Bu donma adım bakterilerin lizis geliştirir.
- Pelet lizis tamponu (100 mM KCl, 1mm DTT, 1mm PMSF, 100 mikrogram / ml lizozim ve Leupeptine 100 mcg / ml fosfat buffer salin (PBS)) 30 ml toplandı. Bu noktadan itibaren, rekombinant protein inaktivasyon önlemek için buz üzerinde lizat tutmak için çok önemliydi. Lizat hiçbir ayarda bir buz-su banyosu sonicated. 4 MSE (Londra, Birleşik Krallık) sonifier gücü yüksek, genlik 5, 30 saniye nabız, 5 dakika 30 saniye dinlenin. Ehmeth bağlı olabilir Bakteriyel DNA Benzonase Nükleazlar (Novagen) 30 dakika buz tedavisi (5 U / sonicated lizat ml), ile kaldırıldı. Lizis BugBuster protein izolasyonu reaktifi (Novagen) 300 mcL 30 dakika ilave edilerek tamamlandı 4 ° C'de orbital çalkalayıcı (100 rpm) yavaşça sallanarak.
- Rekombinant GST-Ehmeth protein üretir talimatları (Sigma) göre glutatyon-agaroz reçine doğal koşullar altında saflaştırılmış. Lizat 25 ml için 500 mcL, bulamaç reçine boncuk eklenir ve 24 inkübe edildi ° C 1 saat süreyle.
- Boncuk, soğuk PBS ile lizis tamponu (lizis tamponu boncuk hacim başına 10 cilt) ve 6 kez ile iki kez yıkandı. Bu geniş yıkama adımları elutio önce hiç Benzonase orada kalır olduğunu sigortan adım.
- Rekombinant Ehmeth protein az 12 saat 4 glutatyon elüsyon tampon 5 ml (50 mM Tris HCl pH 8.0, glutatyon (Sigma) 10 mM) ° C nazik rotasyon ile boncuk kuluçka glutatyon agaroz boncuk madde elde edilmiştir. Boncuk santrifüj (2,000 rpm, 5 dakika) tarafından çıkarıldı ve süpernatant toplandı.
- Süpernatantı elüsyon tampon bir depolama tampon (KCl 200 mM EDTA 10 mM, 0.1 mM DTT, gliserol PBS içinde% 60) tarafından değiştirildi. Bu amaçla, süpernatant 5 ml Millipore Microcon YM-30 santrifüj filtre cihazları, 4 8.000 rpm'de 20 dakika (30 kDa sütun kesilmiş) ve santrifüj ° C üstüne yüklenen Konsantre protein depolama tampon (5 ml) sulandırılmış ve filtre cihazı tekrar edildi. Aynı prosedür, depolama tampon tarafından yürütülmesi tampon tam yedek sigorta için en az 3 kez tekrarlanmalıdır. Son olarak, yoğun protein depolama tampon yaklaşık 300 mcL seyreltilmelidir.
- Rekombinant protein konsantrasyonu Bradford protein testi ile ölçüldü. Rekombinant enzim hazırlık -20 ° C'de saklanan Enzim Final konsantrasyon metilasyon tayini için uygun bir konsantrasyon olarak 3 mg / ml 'den az olmamalıdır.
- SDS-PAGE ile protein hazırlama kontrol edildi.
Uyarı: hazırlanmasında aktif bir enzim sigortalamak için, tüm arıtma adımları buz üzerinde yapılan ve DTT taze hazırlanmalı ve depolama tampon ilave edilmelidir. Bu 6 ay boyunca aktif bir enzim sigortalanır.
3 in vitro tRNA Metilasyon Testi
Çözümler ve hazırlıklı olmalıdır reaktifler:
- 1 M tris (hidroksimetil) aminomethane çözüm. Konsantre hidroklorik asit (HCl) ile çözeltinin pH değeri 8.0 olarak ayarlayın.
- 5X Metilasyon tamponu (MB): 100 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NH 4 oac, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. MB dithiothreitol (DTT) olmadan önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de saklanabilir.
- 101,67 ml distile su ile karıştırılarak 5 mcL AdoMet (New England Biolabs, 32 mM konsantrasyon) etiketsiz S-adenosylmethionine (AdoMet) hisse senedi (son konsantrasyonu 1.5 mM) hazırlayın.
- % 5 Trikloroasetik Asit Çözeltisi (TCA)
- % 100 Etanol
- Başına Sintilasyon sıvı örnek şişesine 3 mL.
Testin:
- Pipeting şeması metilasyon testinin 40 mcL son hacmi (Tablo 2) hazırlanır.
- 1.5 ml Eppendorf tüp, tRNA 5 mcM son bir konsantrasyon (1μg tRNA 40 pmol eşdeğer) DEPC arıtılmış su ile seyreltilmiş
- DTT 4 mcL 8 mcL 5XMB çözüm (stok solüsyonu konsantrasyonu) eklendi.
- TRNA çözümü, 85 ° C'de 2 dakika ve Adım 3 hazırlanan çözüm için hemen eklendi inkübe edildi. Bu karışım, 15 dakika boyunca doğru tRNA kat izin oda sıcaklığında soğuması için izin verildi.
- AdoMet karışımı (nihai konsantrasyonu 200 mcM) etiketli AdoMet 50 mcM (250 μCi, 10,0 Ci / mmol, Perkin Elmer) etiketsiz AdoMet 150 mcM ile karıştırılarak hazırlanmıştır. 10 etiketleme reaksiyonlar için uygun bir AdoMet karışımı için, biz 5.2 unlabeled AdoMet mcL (seyreltilmiş çözüm), distile su mcL 29 etiketli AdoMet mcL ve 5.8 karıştırılır.
- Yukarıda hazırlanan AdoMet karışımı 4 mcL tRNA çözüm eklendi ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe
- TRNA metiltransferaz, Ehmeth (1-10 mcM final konsantrasyon) tRNA substrat ve etiketli-etiketsiz AdoMet kofaktör içeren çözüm eklendi. Karışım 37 ° C'de 3 saat süreyle inkübe Tüpler, onları hafifçe çevirerek inkübasyon süresi boyunca düzenli olarak karıştırılmıştır. Enzimatik reaksiyon kinetik eğrisi üç saatlik bir süre içinde reaksiyon karışımı, her 20 dakikada bir örnek alınarak (8 mcL) tarafından yaptırılmıştır.
- Her numune (Tablo 2 Sütun E olmamalıdır AdoMet örnek dışında bir whatman filtre (0.5 cm çapında) merkezinde hemen fark edildi ve filtre% 5 TCA çözüm batırılmış, 10 dakika boyunca buz üzerinde çalkalanır ) yıkanır. % 5 TCA çözeltisi ile yıkama adımı iki kez daha tekrarlandı.
- Filtre 10 dakika boyunca buz üzerinde% 100 etanol ile yıkandı.
- Hava filtresi en az 20 dakika kurutulur.
- Her kurutulmuş filtre (belirtme) daha önce 3 mL (CytoScint) sintilasyon sıvı ile dolu bir tüp yerleştirilir.
- TRNA dahil radyoaktivite bir sintilasyon sayacı (Sayaç Beta Tri-Carb 2100TR) kullanıyordum.
4. Sorun Giderme
- Sütununda Yüksek değerler A veya B (Tablo 3), kontrol, örnek değerler Sütun C veya D metilasyon reaksiyonu (Tablo 3) → filtreleri düzgün yıkanmış değil beklenen benzer.
- C sütunu veya D (Tablo 3) Düşük değerler, metilasyon deneyler sütununda kontrol reaksiyona benzer değerlere sahip A veya B (Tablo 3) → enzim hiçbir Adomet dahil olduğunu, yani doğru hazır değildi. Başka bir seçenek de tRNA bozulmuş ve enzim için uygun bir substrat olmadığı, bu tRNA örnek bir üre akrilamid jel üzerinde çalışıyor (1.2) ve tRNA bütünlüğünü incelemek için jel boyama etidyum bromür ile kontrol edilebilir .
- D Sütunu düşük değerler (Tablo 3) → Ehmeth faaliyet hDnmt2 enzim performans depolama tampon DTT konsantrasyonu artmaktadır (1 ile 10 arası mM aralığı) veya enzim konsantrasyonu artırmak için daha iyi olabilir sonra daha zayıf olduğundan, enzimin kalitesiz yatıştırmayı.
- E sütununda düşük değerler (Tablo 3) → Bu sütunda bu sütunda değeri düşükse AdoMet artık aktif ve kayıp olduğu anlamına gelir, toplam radyoaktivite etiketli AdoMet değeri (% 100 olarak anılacaktır) temsil eder radyoaktivite.
5. Temsilcisi Sonuçlar
| Reaktif | Final Konsantrasyon | PCR - Program | |||||
| Gentherm PCR Buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 dakika | |||
| MgCl 2 | 3.0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP mix | 1.2 mm | 2. | 90 ° C | 30 sn | 5. | 90 ° C | 30 sn |
| DNA | 15.0 nM | 3. | 54 ° C | 30 sn | 6. | 60 ° C | 30 sn |
| İleri Astar | 3.0 mcM | 4. | 72 ° C | 45 ler | 7. | 72 ° C | 45 ler |
| Ters Astar | 3.0 mcM | 2.-4. 10 döngü | 5.-7. 25 devir | ||||
| Taq Polimeraz | 0.1 U / ml | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | AD 50 ul | kapağı 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 dk | ||
Tablo 1: PCR ve PCR programı için Pipet düzeni.
| A Negatif kontrol (Sadece Ehmeth) | B Negatif kontrol (Sadece tRNA) | C Pozitif kontrol insan Dnmt2 | D Standart Reaksiyon (Enz + Subst + COF) | E Toplam değeri filtre AdoMet | |
| tRNA | - | (3 mg) | (3 mg) | (3 mg) | - |
| hDnmt2 | - | (2.48 mcg) | - | ||
| Ehmeth | (2.48 mcg) | (2.48 mcg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Toplam | 40 mcL | 40 mcL | 40 mcL | 40 mcL | 1 mcL |
Tablo 2: Örnek şeması pipeting düzeni her sütunun bir örnek temsil eder.
* Ehmeth ve hDnmt2 tahmini 62 kDa protein boyutu ile bir GST etiketi erimiş.
Ehmeth sadece içeren bir-Negatif kontrol.
B-sadece tRNA içerir Negatif kontrol.
Insan Dnmt2 C-Pozitif kontrol. Bu enzim, on kez daha Ehmeth fazla aktivite
Enzim, substrat ve kofaktör içeren D-Standart tepki
E-filtre AdoMet toplam değeri. Bu değer, metil grubunun dahil yüzdesinin hesaplanması için kullanılır.
| A Negatif kontrol (Sadece Ehmeth) | B Negatif kontrol (Sadece tRNA) | C Pozitif kontrol insan Dnmt2 | D Standart Reaksiyon (Enz + Subst + COF) | E Toplam değeri filtre AdoMet | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tablo 3: Örnek sintilasyon sayacı okuma değerleri düzeni her sütun Tablo 1'de bir örnek temsil eder.
Şekil 1: (A) T7 transkripsiyon şablonu ve in vitro transkripsiyon için primerler Tüm dizileri, 5 yönlendirme '3' yazılır. ColorCode: metnine bakın. (B) transkripsiyon sırasında ürün oluşumunun Şeması. RNA transkript T7 RNA polimeraz tarafından sentezlenen. Kendi 2D-yapıları ve ribozim içine çekiç ribozim ve tRNA kat, tRNA, 5'-end (9 uyarlanmıştır) hidroksil grubu bırakarak kendisini keser.
Şekil 2:% 1.3 agaroz jel iki farklı şablonlar üzerine 1X GelRed PCR reaksiyonları ile prestained PCR reaksiyon kontrol 100 basepairs artı merdivenin yanında gösterilmektedir. Kontroller bir "şablon sadece" şerit ve ters astar ihmal edildiği reaksiyonları içerir.
Şekil 3: UV-gölgeleme iki transkripsiyon karışımların SAYFA ayrılması gösterilmektedir. UV ışığı, floresan TLC plağı ulaşmasını önlemek beri habercisi transkript Gruplar (bölünme öncesi), tam uzunlukta tRNA ve çekiç ribozim gölgeler gibi görünür hale gelir. Toplam tRNA gelen E. coli boyut belirteci olarak kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda, E. tRNA metiltransferaz aktivite ölçmek için aktif bileşenleri nasıl hazırlanacağını gösterildiği histolytica Ehmeth enzim. Bu prosedür, bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir ve diğer tRNA methyltransferases ölçmek için kolayca adapte edilebilir. TRNA substrat ve tRNA metiltransferaz protein kalitesini ve bütünlüğünü korumak enzimatik aktivite optimal bir ölçüsü sigorta işlemlerini takip etmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı ve Rappaport Aile Enstitüsü Tıp Bilimleri Araştırma ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
