Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für die
Abstract
Einzellige Parasiten gehören zu den verheerendsten Krankheitserreger des Menschen verantwortlich für eine Vielzahl von Erkrankungen wie Amöbiasis, die eine der drei häufigsten Todesursachen von parasitäre Erkrankung ist. Der Agent der Amöbiasis ist die Amöbe Parasiten Entamoeba histolytica, die unter zwei Stufen besteht: die infektiöse Zyste in Nahrung oder Wasser und die invasive Trophozoiten leben im Darm gefunden. Die klinischen Symptome der Amöbiasis Bereich entfernt, asymptomatische zu Kolitis, Ruhr oder Leberabszesse. E. histolytica ist einer der seltenen einzellige Parasit mit 5-Methylcytosin (5MC) in ihrem Genom. 1, 2 Es enthält ein einziges DNA-Methyltransferase, Ehmeth, dass die Dnmt2 Familie gehört. 2 A Rolle für Dnmt2 in der Kontrolle von repetitiven Elementen hat wurde in E. gegründet histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 und Drosophila. 6 Unsere jüngsten Arbeiten haben gezeigt, dass Ehmeth methyliert tRNA Asp, und dieser Befund deutet darauf hin, dass dieses Enzym eine doppelte DNA / tRNA Asp Methyltransferase-Aktivität hat. 7 Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Dual-Aktivität das hat für D. berichtet discoideum und D. melanogaster. 8 Die funktionelle Bedeutung der DNA / tRNA Spezifität von Enzymen Dnmt2 ist noch unbekannt. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine Methode zur tRNA Methyltransferase-Aktivität von Proteinen zu bestimmen Dnmt2 gegründet. In diesem Video, beschreiben wir eine einfache Lösung, um eine ausreichende tRNA Substrat für Dnmt2 vorzubereiten und eine Methode, um ihre tRNA Methyltransferase-Aktivität zu messen.
Protocol
Voraussetzung vor Beginn des Versuchs:
- RNase-freiem Wasser ist in der Handhabung von RNA im Labor verwendet werden, um das Risiko von RNA Abbau durch RNasen zu reduzieren. Zu diesem Zweck, Wasser ist in der Regel mit 0,1% v / v Diethylpyrocarbonat (DEPC) für mindestens 1 Stunde lang bei 37 ° C und anschließend autoklaviert (mindestens 15 min), um Spuren von DEPC zu inaktivieren.
- Pipetman Pipetten sind mit einem RNase-Dekontamination Lösung (RNase Kammerjäger, Biological Industry Beit Haemek) vor Gebrauch gereinigt werden.
- Eppendorf-Röhrchen und Tipps sollten zertifiziert frei von DNase und RNase um die Integrität der Probe zu erhalten.
1. tRNA Asp Vorbereitung
Dieses Verfahren beschreibt eine in vitro run-off-Transkription, die für die Synthese von tRNA verwendet werden können. Dieses Verfahren ist eine Anpassung der Ribozym-Verfahren veröffentlicht zuvor. 9 Zu diesem Zweck ein Template entwickelt, bestehend aus dem T7-Promotor und die komplementären Sequenzen eines selbst-spaltenden Hammerhead-Ribozym und die benötigten tRNA wurde. Die Transkription dieser Vorlage entsteht ein Produkt zu spalten sich auf der 5 `-Ende in einer Weise, die in voller Länge tRNA mit ergibt sich eine 5`-OH anstelle eines phosphorylierten 5 `-Ende. Die full-length tRNA aus gespalten Hammerhead-Ribozym und ungespaltenen Produkte durch Harnstoff-PAGE gereinigt werden.
- PCR-Primer und Template Design:
Um eine effiziente Vorlage für T7-RNA-Polymerase vermittelt in vitro-Transkription erhalten drei Voraussetzungen müssen erfüllt sein.- Die T7-Promotor-Sequenz (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) hat in der Vorlage gebracht werden.
- Zur Erhöhung der Transkription Effizienz sollten die ersten drei Nucleotide der RNA transkribiert werden Guanosin.
- Die richtige komplementäre Sequenz des spezifischen tRNA benötigt wird.
- PCR
Zur Verstärkung der Template-DNA verwendeten wir eine Standard-PCR-Reaktion in einem Endvolumen von 50 ul. Tabelle 1 zeigt die Endkonzentrationen (Reaktion auf Eis vorbereitet) und das Programm für die PCR. Die niedrige Glühtemperatur während der ersten 10 Zyklen Konten für die nur teilweise Bindung der Vorwärts-Primer an die DNA-Template verwendet. Zur Reduzierung der unspezifischen Bindung der Annealingtemperatur wurde für weitere 25 Amplifikationszyklen erhöht.
Der Erfolg der Vorlage Amplifikation wurde durch einen 1,3% igen Agarosegel mit 1X GelRed Lösung (Abbildung 2) prestained getestet. - Transkription
- T7 Vormischung hergestellt werden kann, 5fach konzentrierte (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, 1 mM Spermidin, 5 mM DTT, 2 pg / mL BSA und 0,01% Triton X-100) und wurde für mindestens eine verwendet Woche oder fünf Gefrier Auftau-Zyklen.
- Die Transkription Mischung hat bei Raumtemperatur hergestellt werden.
- Transkriptionsreaktionen wurden unter Verwendung von 80 ul T7 Premix, 80 ul PCR-Produkt, 80 ul NTP-Mix (25 mM) und eingestellt auf 385 ul mit MilliQ Wasser. 15 ul (1,34 mg / mL) T7-RNA-Polymerase (Endkonzentration 0,05 pg / mL) zugesetzt, um die Reaktion zu starten.
- Die Reaktion wurde für 4 h bei 37 ° C. Der weiße Niederschlag von Pyrophosphat zeigt die erfolgreiche Transkription.
- Reinigung
- Pyrophosphat wurde nach 1 Minute bei 10.000 Umdrehungen pro Minute geschleudert.
- Die Überstände wurden mit einem Volumen Formamid Loading-Farbstoff pur geliefertified auf einem 12% Harnstoff-PAGE mit 20 W für 2 Stunden. Demontieren Sie das Gel und legen Sie sie auf Frischhaltefolie.
- Stain das Gel mit 3XGelRed Lösung mit 0,1 M NaCl für 20 Minuten ergänzt. Bei UV-Anregung, beschriften Sie die tRNA-Band auf der Frischhaltefolie mit einem Permanent-Marker für eine spätere Exzision. Alternativ kann, wenn die erwartete Rendite liegt über 50 pg-Banden durch UV-Shadowing zu sehen. Für UV-Shadowing, statt das Gel auf eine fluoreszierende Dünnschichtchromatographie Platte und beleuchten mit einer UV-Handlampe von oben. Label-Bands, die als nicht-fluoreszierenden Schatten in das Gel (Abbildung 3), für die spätere Exzision erscheinen.
- tRNA-Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und in 1,5 mL Eppendorf-Cups.
- Nach Zugabe von 450 ul 0,5 M NH 4 OAc werden die Proben bei -80 ° C für 2 Stunden und danach bei 20 ° C inkubiert, Schütteln mit 550 rpm auf einem Eppendorf Thermoschüttler über Nacht. 6. Der Überstand NH 4 OAc Lösungen aus Schritt 5 mit Nanosep Röhren (0,45 um) filtriert, Spinning 90 Sekunden bei 8.500 Umdrehungen pro Minute zu PAGE Ablagerungen zu entfernen.
- Fällung von eluiert tRNAs wurde durch Zugabe von 2,5 Volumina von -80 ° C mit reinem Ethanol (pa), Lagerung bei -20 ° C über Nacht und 2,5 h Zentrifugation bei 4 ° C und 15.500 Umdrehungen pro Minute. Durchgeführt
- Nach Entfernen des Überstands Pellets wurden in einem SpeedVac getrocknet und in MilliQ Wasser.
- Die Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Nanodrop-ND1000. Die Ausbeute von einem 400 ul Transkription wurde etwa 80-100 ug.
Fehlerbehebung:
- Kein PCR-Produkt. → Ist die Reihenfolge der Primer und Template-kompatibel und sind alle Komponenten im Inneren des Reaktionsgemisches?
- Keine Transkription Produkt. → PCR hätte keinen Erfolg haben. Richtig T7-Promotorsequenz. Lösungen zu kalt während der Vorbereitung der Reaktion. T7 Premix zu alt.
- Produkt auf dem Gel, aber keine eluiert Produkt. → Ethanol für die Fällung nicht kalt genug, nicht rein, nicht das richtige Volumen.
2. Expression und Aufreinigung der rekombinanten E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Protein in E. coli BL21
Dieses Protokoll ist auch für die Herstellung von Dnmt2 Proteine aus menschlichem 10 und Drosophila geeignet. 11
- Die E. histolytica Ehmeth Gen wurde durch PCR amplifiziert, kloniert in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) und verifiziert mit Sequenzierung
- Das rekombinante Plasmid wurde in E. verwandelt coli (BL21) für die Expression von rekombinanten Proteinen.
- Transformierten Bakterien wurden auf Luria-Bertani (LB)-Agar Ampicillin (100 pg / ml) selektioniert. Vier bis fünf Kolonien wurden aufgegriffen und geimpft in 5 ml LB-Medium mit geeigneten selektiven Marker (100 ug / ml Ampicillin) und über Nacht in einem Schüttler bei 37 ° C.
- Die Kultur gezüchtet wurde über Nacht in 500 ml 2X Hefeextrakt Trypton (2xYT)-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin beimpft und in einem Schüttler bei 37 ° C, bis die OD 600 der Kultur erreicht 0,8.
- Die Expression des Dnmt2 rekombinante Protein wurde durch Zugabe von Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,5 mM, die Kultur induziert. Die Kultur wurde weiter in einem Schüttler für 16 Stunden lang bei 24 ° C. Die Dauer und Temperatur der Inkubation wurden optimiert, um die Bildung von inclusion bodies zu vermeiden.
- Die Kultur wurde bei 4 ° C zentrifugiert, 6.000 rpm, in 200 ml Nalgene Röhrchen für 15 Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde bei -70 ° C für mindestens 1 Stunde gesperrt. Das Einfrieren Schritt verbessert die Lyse der Bakterien.
- Das Pellet wurde in 30 ml Lysepuffer (100 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 ug / ml Lysozym und Leupeptin 100 ug / mL in Phosphatpuffer (PBS)) geerntet. Ab diesem Zeitpunkt war es entscheidend, das Lysat auf Eis zu halten, um die Inaktivierung des rekombinanten Proteins zu verhindern. Das Lysat wurde in einem Eis-Wasserbad bei Einstellung keine beschallt. 4 of a MSE (London, United Kingdom) sonifier (Macht hoch, Amplitude 5, 30 Sekunden Puls, 30 Sekunden Pause für 5 Minuten). Bakterielle DNA, die Ehmeth befestigt werden können, wurde mit Benzonase Nuclease (Novagen) Behandlung (5 U / mL beschallte Lysat), für 30 Minuten auf Eis entfernt. Die Lyse wurde durch Zugabe von 300 ul BugBuster Proteinextraktion Reagenz (Novagen) für 30 Minuten auf Abschluss bei 4 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler (100 rpm).
- Das rekombinante GST-Ehmeth Protein wurde unter nativen Bedingungen auf einem Glutathion-Agarose-Harz nach den Anweisungen des Herstellers (Sigma) gereinigt. Für 25 ml Lysat wurden 500 ul von Gülle Harzperlen hinzugefügt und bei 24 ° C inkubiert für 1 Stunde.
- Die Beads wurden zweimal mit Lysepuffer (10 Bände Lysepuffer pro Volumen von Kugeln) und 6-mal mit kaltem PBS gewaschen. Diese umfangreichen Waschschritte Versichee, dass es keine von Benzonase bleiben, bevor die Elution Schritt.
- Rekombinante Ehmeth Protein wurde von der Glutathion-Agarose-Beads durch Inkubation der Beads mit 5 ml Glutathion-Elutionspuffer (Tris HCl 50 mM pH 8,0, Glutathion (Sigma) 10 mM) für 12 Stunden bei 4 ° C unter vorsichtigem Drehen eluiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation (2.000 rpm, 5 Minuten) entfernt und der Überstand wurde gesammelt.
- Der Elutionspuffer im Überstand wurde durch einen Pufferspeicher (200 mM KCl, 10 mM EDTA, 0,1 mM DTT, Glycerol 60% in PBS) ersetzt. Zu diesem Zweck wurden 5 ml Überstand auf der Oberseite eine Millipore Microcon YM-30 Zentrifugalfilter Geräte (30 kDa off Spalte cut) und zentrifugiert bei 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei 4 ° C geladen Das Konzentrat Protein wurde in Pufferspeicher (5 mL) verdünnt und erneut geladen auf dem Filter-Gerät. Das gleiche Verfahren sollte mindestens 3-mal wiederholt werden, um vollständigen Ersatz der Elutionspuffer von der Pufferspeicher zu versichern. Schließlich konzentrierte Protein sollte in etwa 300 ul Lagerpuffer verdünnt werden.
- Die Konzentration des rekombinanten Proteins wurde durch einen Bradford-Protein-Assay gemessen. Das rekombinante Enzym Präparat wurde bei -20 ° C gelagert Endkonzentration des Enzyms sollte nicht weniger als 3 g / ul als geeignete Konzentration für die Methylierungs-Assay.
- Die Protein-Präparation wurde durch SDS-PAGE überprüft.
Hinweis: die Vorbereitung eines aktiven Enzyms zu versichern, sollten alle Reinigungsschritte auf Eis durchgeführt werden und DTT sollte frisch zubereitet werden und zu den Pufferspeicher. Dadurch wird sichergestellt, ein aktives Enzym für 6 Monate.
3. In vitro TRNA Methylierungs-Assay
Lösungen und Reagenzien, die vorbereitet werden sollte:
- 1 M Lösung von Tris (hydroxymethyl) aminomethan. Den pH-Wert der Lösung auf 8,0 mit konzentrierter Salzsäure (HCl).
- 5X Methylierung Puffer (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NH 4 OAc, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. Das MB kann im Voraus zubereitet werden und bei -20 ° C ohne Dithiothreitol (DTT).
- Bereiten Sie die unmarkierte S-Adenosylmethionin (AdoMet) Lager (Endkonzentration 1,5 mM) durch Mischen von 5 ul AdoMet (New England Biolabs, 32 mM Konzentration) mit 101,67 ml destilliertem Wasser.
- 5% Trichloressigsäure (TCA)
- 100% Ethanol
- Szintillationsflüssigkeit 3 mL pro Probenfläschchen.
Der Test:
- Ein Pipettieren Schema hergestellt (Tabelle 2) für einen 40 ul Gesamtvolumen von Methylierungs-Assay.
- In einem 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen wurde tRNA mit DEPC behandeltem Wasser auf eine Endkonzentration von 5 uM (1 g tRNA entspricht 40 pmol) verdünnt
- 4 ul DTT zugegeben (Konzentration der Stammlösung) zu 8 ul 5XMB Lösung.
- Die tRNA-Lösung wurde bei 85 ° C inkubiert für 2 Minuten und die Lösung in Schritt 3 erstellt wurde sofort ihr hinzugefügt. Die Mischung wurde abkühlen gelassen bei Raumtemperatur für 15 Minuten auf die tRNA korrekt falten lassen.
- Die AdoMet Mix (Endkonzentration 200 nM) wurde durch Mischen von 50 uM von markierten AdoMet (250 Ci, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) mit 150 uM unmarkiertem AdoMet vorbereitet. Für eine AdoMet Mix für 10 Markierungsreaktionen wir 5,2 ul von unmarkiertem AdoMet (aus der verdünnten Lösung), 29 ul der markierten AdoMet und 5,8 ul destilliertem Wasser gemischt.
- 4 ul der AdoMet mischen oben hergestellt wurde, um die tRNA-Lösung zugegeben und für 2 Minuten bei 37 ° C.
- Die tRNA-Methyltransferase, Ehmeth (1-10 uM Endkonzentration) wurde die Lösung mit den tRNA Substrat und dem markierten-unmarkiertem AdoMet Cofaktor aufgenommen. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei 37 ° C inkubiert Die Röhrchen wurden regelmäßig während der Zeit der Inkubation durch leichtes Kippen sie gemischt. Eine kinetische Kurve der enzymatischen Reaktion wurde durch Aufnahme alle 20 Minuten eine Probe (8 mL) aus dem Reaktionsgemisch über einen Zeitraum von 3 Stunden aufgebaut.
- Jede Probe wurde sofort auf die Mitte eines Whatman-Filter (0,5 cm Durchmesser) entdeckt und der Filter wurde in eine 5% ige TCA-Lösung getränkt und aufgeregt auf Eis für 10 Minuten (mit Ausnahme der AdoMet Probe, Tabelle 2 Spalte E, die nicht sein sollten gewaschen). Der Waschschritt mit 5% TCA-Lösung wurde zwei weitere Male wiederholt
- Der Filter wurde mit 100% Ethanol auf Eis für 10 Minuten gewaschen.
- Der Filter wurde für mindestens 20 Minuten an der Luft getrocknet.
- Jedes getrocknete Filter wurde in ein Rohr (Spezifikation), die zuvor mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit (CytoScint) gefüllt war gelegt
- Die Radioaktivität in der tRNA eingebaut wurde mit einem Szintillationszähler (Counter Beta Tri-Carb 2100TR).
4. Fehlerbehebung
- Hohe Werte in Spalte A oder B (Tabelle 3) wurden die Kontrollprobe Werte ähnlich denen aus dem m erwartetEthylierung Reaktion in Spalte C oder D (Tabelle 3) → wurden die Filter nicht richtig gewaschen.
- Niedrige Werte in Spalte C oder D (Tabelle 3) hatte die Methylierung Experimente ähnliche Werte der Kontroll-Reaktion in der Spalte A oder B (Tabelle 3) → das Enzym nicht richtig vorbereitet bedeutet, dass es keine AdoMet Statuten. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die tRNA abgebaut war und nicht ein geeignetes Substrat für das Enzym, kann dies, indem Sie die tRNA Probe auf einem Harnstoff Acrylamid-Gel (siehe 1.2) und Färbung des Gels mit Ethidiumbromid, um die Integrität der tRNA untersuchen überprüft werden .
- Niedrige Werte in Spalte D (Tabelle 3) → da die Aktivität der Ehmeth schwächer ist dann hDnmt2 das Enzym durch die Erhöhung der DTT-Konzentration in der Storage-Puffer (kann zwischen 1-10 mm-Bereich) oder die Enzymkonzentration zu erhöhen verbessert werden kann palliate die schlechte Qualität des Enzyms.
- Niedrige Werte in Spalte E (Tabelle 3) → dieser Spalte steht der gesamten Radioaktivität des markierten AdoMet Wert (bezeichnet als 100%), wenn der Wert in dieser Spalte ist niedrig, bedeutet, dass die AdoMet nicht mehr aktiv ist und hat ihre Radioaktivität.
5. Repräsentative Ergebnisse
| Reagens | Endkonzentration | PCR - Programm | |||||
| Gentherm PCR Buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3,0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP-Mix | 1,2 mM | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Template DNA | 15,0 Nm | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Vorwärts-Primer | 3,0 um | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Reverse-Primer | 3,0 um | 2.-4. 10 Zyklen | 5.-7. 25 Zyklen | ||||
| Taq-Polymerase | 0,1 U / ul | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Ad 50 pl | Deckel 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabelle 1: Pipette Regelung für PCR-und PCR-Programm.
A | B Negative Kontrolle (TRNA nur) | C Positive Kontrolle mit menschlichen Dnmt2 | D Standard-Reaktion (Enz + Subst + COF) | E Gesamtwert der AdoMet auf dem Filter | |
| tRNA | - | (3 ug) | (3 ug) | (3 ug) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 ug) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 ug) | (2,48 ug) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| ddw | - | ||||
| Gesamt | 40 ul | 40 ul | 40 ul | 40 ul | 1 ul |
Tabelle 2:. Beispiel Pipettieren Schema Jede Spalte in der System stellt eine Probe.
* Beide Ehmeth und hDnmt2 wurden zu einem GST-Tag mit einem geschätzten Größe des Proteins von 62 kDa verschmolzen.
A-Negativ-Kontrolle, dass Ehmeth nur enthält.
B-Negativ-Kontrolle, dass tRNA enthält nur.
C-Positive Kontrolle mit menschlichen Dnmt2. Dieses Enzym hat zehn Mal mehr einctivity als Ehmeth
D-Standard-Reaktion, dass das Enzym, das Substrat und den Cofaktor enthält
E-Gesamtwert der AdoMet auf dem Filter. Dieser Wert wird für die Berechnung des Prozentsatzes von Methyl-Gruppe eingegliedert werden.
| A Negative Kontrolle (Ehmeth only) | B Negative Kontrolle (TRNA nur) | C Positive Kontrolle mit menschlichen Dnmt2 | D Standard-Reaktion (Enz + Subst + COF) | E Gesamtwert der AdoMet auf dem Filter | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tabelle 3:. Beispiel von Werten durch den Szintillationszähler gelesen Jede Spalte in der System stellt eine Probe aus Tabelle 1.
Abbildung 1: (A) T7 Transkription Vorlage und Primer für in vitro-Transkription. Alle Sequenzen sind in 5 'nach 3' Orientierung geschrieben. Farbcode: siehe Text. (B) Schema der Produktbildung während der Transkription. Die RNA-Transkript wird durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert. Hammerhead-Ribozym und tRNA falten sich in ihren jeweiligen 2D-Strukturen und das Ribozym spaltet sich der tRNA verlässt eine Hydroxylgruppe an ihrem 5'-Ende (nach 9).
Abbildung 2:. PCR-Reaktion Steuerelement auf einem 1,3% Agarosegel mit 1X GelRed PCR-Reaktionen auf zwei verschiedenen Vorlagen prestained sind neben einem 100 Basenpaare sowie Leiter gezeigt. Die Kontrollen umfassen eine "Vorlage nur" Spur und Reaktionen, bei denen der Reverse-Primer wurde verzichtet.
Abbildung 3:. UV-Shadowing A PAGE Trennung von zwei Transkription Mischungen dargestellt. Bands der Vorläufer-Transkripte (vor Spaltung), werden in voller Länge tRNA und Hammerhead-Ribozym sichtbar als Schatten, da sie UV-Licht verhindert, das Erreichen der fluoreszierenden DC-Platte. Insgesamt tRNA aus E. coli als Größenmarker eingesetzt.
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Discussion
In diesem Vortrag dargestellt wir, wie man aktive Komponenten für das Maß der tRNA Methyltransferase-Aktivität von E. vorbereiten histolytica Ehmeth Enzym. Dieser Vorgang kann als Ausgangspunkt dienen und einfach für die Maßnahme von anderen tRNA-Methyltransferasen angepasst werden. Es ist wichtig, die Verfahren, die die Qualität und die Integrität der tRNA Substrat und der tRNA-Methyltransferase-Protein zu erhalten, um eine optimale Maß für die enzymatische Aktivität zu versichern folgen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Israel Science Foundation und der Rappaport Family Institute for Research in Medical Sciences und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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