Summary
Ce protocole décrit la préparation d'un substrat synthétique pour l'ARNt
Abstract
Les parasites protozoaires sont parmi les agents infectieuses les plus dévastatrices de l'homme responsable d'une variété de maladies, notamment l'amibiase, qui est l'une des trois causes les plus fréquentes de décès par maladie parasitaire. L'agent de l'amibiase est l'amibe parasite Entamoeba histolytica qui existe sous deux étapes: le kyste infectieux présents dans les aliments ou l'eau et les vivants trophozoïte envahissantes dans l'intestin. Les manifestations cliniques de l'amibiase large d'être asymptomatique à la colite abcès, la dysenterie ou le foie. E. histolytica est l'un des rares du parasite unicellulaire, avec le 5-méthylcytosine (5mC) dans son génome. 1, 2 Il contient un ADN simple méthyltransférase, Ehmeth, qui appartient à la famille Dnmt2. 2 Un rôle pour Dnmt2 dans le contrôle des éléments répétitifs a été établi dans E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 et la drosophile. 6 Nos travaux récents ont montré que Ehmeth méthylates ARNt Asp, et cette constatation indique que cette enzyme a un ADN double / ARNt Asp activité méthyltransférase. 7 Cette observation est en accord avec la double activité qui a été rapporté pour D. discoideum et D. melanogaster. 8 La signification fonctionnelle de la spécificité ADN / ARNt de Dnmt2 enzymes est encore inconnue. Pour répondre à cette question, une méthode pour déterminer l'ARNt activité méthyltransférase d'Dnmt2 protéines a été établie. Dans cette vidéo, nous décrivons une approche simple pour préparer un substrat adéquat pour Dnmt2 ARNt et une méthode pour mesurer son activité ARNt méthyltransférase.
Protocol
Préalable avant d'initier l'expérience:
- L'eau sans RNase est utilisé dans le traitement de l'ARN dans le laboratoire pour réduire le risque d'ARN étant dégradés par les RNases. À cette fin, l'eau est habituellement traitée avec 0,1% v / v diéthylpyrocarbonate (DEPC) pendant au moins 1 heure à 37 ° C, puis autoclavés (au moins 15 min) pour inactiver les traces de DEPC.
- Pipettes Pipetman sont nettoyées avec une solution de décontamination RNase (RNase exterminateur, biologique Industrie Beit Haemek) avant utilisation.
- Des tubes Eppendorf et des conseils doivent être certifiés exempts de DNase et RNase pour préserver l'intégrité des échantillons.
1. ARNt Asp Préparation
Cette procédure décrit in vitro ruissellement de transcription qui peut être utilisé pour la synthèse de tout ARNt. Cette procédure est une adaptation de la méthode ribozyme publiés précédemment. 9 A cet effet, un modèle a été conçu constituée du promoteur T7 et les séquences complémentaires d'un ribozyme auto-clivage marteau et l'ARNt nécessaires. Transcription des résultats de ce modèle dans un produit se fendant à la 5 `-end en sorte que l'ARNt pleine longueur est obtenue avec un 5-OH` au lieu d'un phosphorylée 5 `-end. L'ARNt pleine longueur peut être purifiée à partir clivé marteau ribozyme et produits non clivée par l'urée-PAGE.
- Primer PCR et Template Design:
Afin d'obtenir un modèle efficace pour la T7 RNA polymérase médiation transcription in vitro à trois exigences doivent être remplies.- La séquence promoteur T7-(5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) doit être impliquée dans le modèle.
- Pour accroître l'efficacité de la transcription, les trois premiers nucléotides de l'ARN transcrit devrait être guanosine.
- La séquence correcte de l'ARNt complémentaires spécifiques sont nécessaires.
- PCR
Pour l'amplification de l'ADN matrice, nous avons utilisé une réaction PCR standard dans un volume final de 50 ul. Le tableau 1 présente les concentrations finales (réaction préparés sur glace) et le programme pour la PCR. Le recuit à basse température utilisée au cours des cycles de 10 comptes initiaux pour la liaison partielle de l'amorce sens de la matrice d'ADN. Afin de réduire non spécifiques liant la température de recuit a été augmentée pour encore 25 cycles d'amplification.
Le succès de l'amplification modèle a été testé par un gel d'agarose 1,3% précolorés avec 1X solution GelRed (figure 2). - Transcription
- Prémélange T7 peut être préparé 5X concentrée (200 mM Tris-HCI, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, 1 mM spermidine, DTT 5 mM, 2 pg / ml de BSA et 0,01% de Triton X-100) et a été utilisé pendant au moins un semaine ou cinq cycles de gel-dégel.
- Le mélange de transcription doit être préparée à température ambiante.
- Réactions de transcription ont été préparés en utilisant 80 uL prémélange T7, 80 uL de produits PCR, 80 uL mélange de NTP (25 mM) et ajusté à 385 uL d'eau MilliQ. 15 uL (1,34 mg / mL) T7 RNA polymérase (concentration finale 0,05 pg / pl) sont ajoutés pour démarrer la réaction.
- La réaction a été réalisée pendant 4 h à 37 ° C. Le précipité blanc de pyrophosphate indique la transcription réussie.
- Purification
- Pyrophosphate a été centrifugé pendant 1 minute à 10000 rpm.
- Les surnageants ont été fournis avec un volume de chargement et de colorant formamide PURréserve sur une urée-PAGE 12% en utilisant 20 W pendant 2 heures. Démonter le gel et le placer sur Saran Wrap.
- Tache le gel avec une solution 3XGelRed supplémenté avec 0,1 M de NaCl pendant 20 minutes. Après excitation UV, l'étiquette la bande ARNt sur la pellicule saran avec un marqueur permanent pour l'excision tard. Alternativement, si le rendement attendu est supérieur à 50 mg bandes peut être vu par les UV-ombrage. Pour les UV jumelage, placez le gel sur une plaque de chromatographie sur couche mince fluorescentes et éclairer avec une lampe UV-lampe à la main d'en haut. Des bandes d'étiquettes, qui apparaissent comme non fluorescent ombres dans le gel (Figure 3), pour l'excision tard.
- des bandes d'ARNt ont été excisées avec un scalpel et de mettre en 1,5 tasses Eppendorf ml.
- Après addition de 450 ul de 0,5 M NH 4 OAc les échantillons sont congelés à -80 ° C pendant 2 heures puis incubées à 20 ° C, en agitant avec 550 rpm sur une Thermoshaker Eppendorf pendant la nuit. 6. Le surnageant NH 4 OAc solutions de l'étape 5 sont filtrées avec Nanosep tubes (0,45 um), la filature 90 secondes à 8500 tours par minute pour enlever les débris PAGE.
- La précipitation des ARNt élue a été réalisée en ajoutant 2,5 volumes de -80 ° C d'éthanol pur (PA), le stockage à -20 ° C la nuit et de centrifugation 2,5 h à 4 ° C et 15 500 rpm.
- Après avoir retiré le surnageant granulés sont séchés dans un SpeedVac et remises en suspension dans de l'eau MilliQ.
- Les concentrations ont été déterminées en utilisant un Nanodrop-ND1000. Le rendement d'une transcription de 400 uL était environ 80-100 mg.
Dépannage:
- Aucun produit de PCR. → est la séquence des amorces et un modèle compatible et sont tous les composants à l'intérieur du mélange réactionnel?
- Aucun produit de transcription. → PCR pourrait avoir été infructueuses. Corrigez-T7 promoteur séquence. Solutions trop froid pendant la préparation de la réaction. Premix T7 trop vieux.
- Produit sur le gel, mais aucun produit élué. → L'éthanol pour les précipitations pas assez froid, pas pur, et non pas le volume correct.
2. Expression et purification de la protéine recombinante E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) de protéines dans E. coli BL21
Ce protocole est également adapté pour la préparation de protéines à partir de Dnmt2 humaine 10 et la drosophile. 11
- Le E. histolytica Ehmeth gène a été amplifié par PCR, clonés dans pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) et vérifié avec le séquençage
- Le plasmide recombinant a été transformé en E. coli (BL21) pour l'expression de protéines recombinantes.
- Les bactéries transformées ont été sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB) agar ampicilline (100 pg / mL) à moyen terme. Quatre à cinq colonies ont été ramassés et inoculée dans 5 ml de milieu LB avec marqueur sélectif approprié (100 pg / ml d'ampicilline) et incubé pendant une nuit dans un agitateur orbital à 37 ° C.
- La culture cultivées pendant une nuit a été inoculé dans 500 ml d'extrait de levure tryptone 2X (2xYT) moyenne de 100 ug / ml d'ampicilline et incubées dans un agitateur orbital à 37 ° C jusqu'à une DO 600 de la culture a atteint 0,8.
- L'expression de la protéine recombinante a été Dnmt2 induite par addition d'isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,5 mM à la culture. La culture a été incubée encore dans un agitateur orbital pendant 16 heures à 24 ° C. L'heure et la température d'incubation ont été optimisées pour éviter la formation de corps d'inclusion.
- La culture a été centrifugée à 4 ° C, 6000 rpm, dans 200 ml tubes Nalgene pendant 15 minutes. Le surnageant est écarté et le culot est congelé à -70 ° C pendant au moins 1 heure. Cette étape de congélation améliore la lyse des bactéries.
- Le culot a été récoltées dans 30 ml de tampon de lyse (100 mM de KCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 ug / ml de lysozyme et de leupeptine 100 pg / mL dans un tampon phosphate salin (PBS)). De ce point, il était essentiel de maintenir le lysat sur la glace pour éviter l'inactivation de la protéine recombinante. Le lysat a été soniquée dans un bain d'eau glacée à mettre aucune. 4 d'un MSE (Londres, Royaume-Uni) sonificateur (forte puissance, d'amplitude 5, 30 impulsions secondes, 30 secondes de repos pendant 5 minutes). L'ADN bactérien qui peut être attaché à Ehmeth a été enlevé avec Benzonase Nuclease (Novagen) traitement (5 U / ml de lysat soniqué), pendant 30 minutes sur la glace. La lyse a été complété par l'ajout de 300 ul de réactif d'extraction de protéines BugBuster (Novagen) pendant 30 minutes sur à 4 ° C avec agitation douce sur un agitateur orbital (100 rpm).
- Le recombinant GST-Ehmeth protéine a été purifiée dans des conditions natives sur une résine de glutathion-agarose selon les instructions fabrique (Sigma). Pour 25 ml de lysat, 500 pi de billes de résine boue ont été ajoutés et incubés à 24 ° C pendant 1 heure.
- Les billes ont été lavées deux fois avec un tampon de lyse (10 volumes de tampon de lyse par volume de perles) et 6 fois avec du PBS froid. Ces lavez vaste assurance étapese qu'il n'y avait pas encore de Benzonase avant l'étape d'élution.
- La protéine recombinante Ehmeth été élue de la glutathion billes d'agarose en incubant les billes avec 5 ml de tampon d'élution glutathion (Tris HCl pH 8.0 50 mM, glutathion (Sigma) 10 mM) pendant 12 heures à 4 ° C avec une légère rotation. Les billes ont été éliminés par centrifugation (2000 rpm, 5 minutes) et le surnageant a été recueilli.
- Le tampon d'élution dans le surnageant a été remplacé par un tampon de stockage (KCl 200 mM, EDTA 10 mM, 0,1 mM de DTT, glycérol 60% dans du PBS). Pour ce faire, 5 ml de surnageant a été chargé sur le dessus une Millipore Microcon YM-30 centrifuges dispositifs de filtrage (30 kDa coupé colonne) et centrifugé à 8000 rpm pendant 20 minutes à 4 ° C. Le concentré de protéines a été dilué dans un tampon de stockage (5 ml) et rechargées sur le dispositif de filtrage. La même procédure doit être répétée au moins 3 fois pour assurer le remplacement complet du tampon d'élution par le tampon de stockage. Enfin la protéine concentrée doit être diluée dans environ 300 pi de tampon de stockage.
- La concentration de la protéine recombinante a été mesurée par un dosage de protéines de Bradford. La préparation enzyme recombinante a été stocké à -20 ° C. La concentration finale de l'enzyme ne doit pas être inférieure à 3 pg / pl comme une concentration appropriée pour le dosage de la méthylation.
- La préparation de protéines a été vérifiée par SDS-PAGE.
Avis: pour assurer la préparation d'une enzyme active, toutes les étapes de purification devrait être fait sur la glace et la TNT doit être fraîchement préparée et ajoutée à la mémoire tampon de stockage. Ceci assure une enzyme active pendant 6 mois.
3. Dosage in vitro de méthylation TRNA
Solutions et réactifs qui doivent être préparés:
- Solution 1 M de tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Ajuster le pH de la solution à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique concentré (HCl).
- La méthylation de tampon 5X (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100 mM de NH 4 OAc, EDTA 0,1 mM, MgCl2 10 mM. Le Mo peut être préparé à l'avance et stocké à -20 ° C sans dithiothréitol (DTT).
- Préparer la non étiquetés S-adénosylméthionine (AdoMet) stock (concentration finale 1,5 mM) en mélangeant 5 uL AdoMet (New England Biolabs, 32 mM de concentration) avec 101,67 ml d'eau distillée.
- 5% Solution d'acide trichloracétique (TCA)
- L'éthanol à 100%
- Scintillation liquide 3 mL par flacon d'échantillon.
Le dosage:
- Un schéma de pipetage est préparé (tableau 2) pour un volume final 40 uL de dosage de méthylation.
- Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, ARNt a été dilué avec de l'eau traitée au DEPC à une concentration finale de 5 uM (1 pg d'ARNt est équivalent à 40 pmol)
- 4 pl de la TNT a été ajouté (concentration de la solution stock) à 8 uL de solution 5XMB.
- La solution d'ARNt a été incubé à 85 ° C pendant 2 minutes et la solution préparée à l'étape 3 a été ajouté immédiatement à elle. On laisse le mélange refroidir à température ambiante pendant 15 minutes pour laisser le pli ARNt correctement.
- Le mélange AdoMet (concentration finale 200 uM) a été préparé en mélangeant 50 uM de étiquetés AdoMet (250 pCi, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) avec 150 M de non étiquetés AdoMet. Pour un mélange AdoMet pour 10 réactions de marquage, nous avons mélangé 5,2 ul de non étiquetés AdoMet (à partir de la solution diluée), 29 uL d'AdoMet étiquetés et 5,8 ul d'eau distillée.
- 4 ul du mélange préparé ci-dessus a été AdoMet ajouté à la solution d'ARNt et incubées pendant 2 minutes à 37 ° C.
- L'ARNt méthyltransférase, Ehmeth (concentration 10 à 10 uM final) a été ajouté à la solution contenant le substrat ARNt et le cofacteur étiquetés sans étiquette-AdoMet. Le mélange a été incubé pendant 3 heures à 37 ° C. Les tubes ont été mélangés régulièrement pendant le temps de l'incubation par doucement en les retournant. Une courbe de cinétique de la réaction enzymatique a été construit en prenant toutes les 20 minutes un échantillon (8 uL) à partir du mélange réactionnel sur une période de trois heures.
- Chaque échantillon a été immédiatement repéré sur le centre d'un filtre Whatman (0,5 cm de diamètre) et le filtre a été trempé dans une solution à 5% de TCA et agités sur la glace pendant 10 minutes (sauf pour l'échantillon AdoMet, la colonne E du tableau 2 que ne devraient pas être lavés). L'étape de lavage avec une solution de TCA 5% a été répété deux fois plus
- Le filtre a été lavé avec de l'éthanol à 100% sur la glace pendant 10 minutes.
- Le filtre a été séché à l'air pendant un minimum de 20 minutes.
- Chaque filtre séché a été placé dans un tube (spécification) qui a été préalablement remplie avec 3 ml de liquide de scintillation (CytoScint)
- La radioactivité incorporée dans l'ARNt a été en utilisant un compteur à scintillation (compteur bêta Tri-Carb 2100TR).
4. Dépannage
- Des valeurs élevées dans la colonne A ou B (tableau 3), les valeurs des échantillons de contrôle ont été similaires à ceux attendus de la mréaction éthylation dans la colonne C ou D (tableau 3) → les filtres ne sont pas lavés correctement.
- Les faibles valeurs dans la colonne C ou D (tableau 3), les expériences méthylation avait des valeurs similaires à la réaction de contrôle dans la colonne A ou B (tableau 3) → l'enzyme n'a pas été préparé correctement, ce qui signifie qu'il n'y avait pas d'incorporation AdoMet. Une autre option est que l'ARNt a été dégradé et n'a pas été un substrat approprié pour l'enzyme, ce qui peut être vérifié en exécutant l'échantillon ARNt sur un gel d'acrylamide urée (voir 1.2) et la coloration du gel au bromure d'éthidium pour examiner l'intégrité de l'ARNt .
- Les faibles valeurs dans la colonne D (tableau 3) → puisque l'activité de Ehmeth est plus faible, puis hDnmt2 la performance enzyme peut être améliorée en augmentant la concentration de DTT dans le tampon de stockage (peut varier entre 1 à 10 mM) ou d'augmenter la concentration de l'enzyme de pallier la mauvaise qualité de l'enzyme.
- Les faibles valeurs de la colonne E (tableau 3) → cette colonne représente la radioactivité totale de la valeur AdoMet étiquetés (appelé 100%), si la valeur dans cette colonne est faible, cela signifie que l'AdoMet n'est plus actif et a perdu sa radioactivité.
5. Les résultats représentatifs
| Réactifs | Concentration finale | PCR - le programme | |||||
| Gentherm tampon PCR | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3,0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| mélange de dNTP | 1,2 mM | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Matrice d'ADN | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Amorce sens | 3,0 uM | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Amorce antisens | 3,0 uM | 2.-4. 10 cycles | 5.-7. 25 cycles | ||||
| Taq Polymérase | 0,1 U / ul | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Annonce 50 ul | Couvercle 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tableau 1: Schéma de pipette pour la PCR et le programme de PCR.
Une | B Contrôle négatif (ARNt seulement) | C Contrôle positif avec Dnmt2 humaine | D Réaction standard (Enz + + Subst Cof) | E La valeur totale de l'AdoMet sur le filtre | |
| ARNt | - | (3 ug) | (3 ug) | (3 ug) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 mg) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 mg) | (2,48 mg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| TNT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Total des | 40 ul | 40 ul | 40 ul | 40 ul | 1 ul |
Tableau 2:. Exemple de pipetage schéma Chaque colonne dans le schéma représente un échantillon.
* Les deux Ehmeth et hDnmt2 ont été fusionnés à une balise TPS avec une taille estimée de la protéine 62 kDa.
A-contrôle négatif qui ne comprend que Ehmeth.
B-contrôle négatif ARNt qui comprend seulement.
C-contrôle positif avec Dnmt2 humaine. Cette enzyme a dix fois plus unectivité de Ehmeth
D-standard qui comprend la réaction de l'enzyme, le substrat et le cofacteur
E-La valeur totale de l'AdoMet sur le filtre. Cette valeur est utilisée pour le calcul du pourcentage de groupe méthyle incorporé.
| Une Contrôle négatif (Ehmeth seulement) | B Contrôle négatif (ARNt seulement) | C Contrôle positif avec Dnmt2 humaine | D Réaction standard (Enz + + Subst Cof) | E La valeur totale de l'AdoMet sur le filtre | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tableau 3:. Exemple de valeurs lues par le compteur à scintillation Chaque colonne dans le schéma représente un échantillon du tableau 1.
Figure 1: (A) modèle de transcription T7 et des amorces pour la transcription in vitro. Toutes les séquences sont écrites en 5 'à 3' orientation. ColorCode: voir texte. (B) Schéma de formation du produit lors de la transcription. La transcription d'ARN est synthétisée par la T7 RNA polymérase. Hammerhead ribozyme et ARNt fois dans leurs respectifs 2D-structures et le ribozyme se clive de l'ARNt de quitter un groupe hydroxyle à leur extrémité 5 '(adapté de 9).
Figure 2:. Contrôler la réaction PCR sur un gel d'agarose 1,3% précolorés avec 1X réactions PCR GelRed sur deux modèles différents sont représentés aux côtés de 100 paires de bases, plus l'échelle. Les contrôles comprennent un "modèle seul" voies et de réactions dans laquelle l'amorce inverse a été omise.
Figure 3:. UV-ombre Une séparation PAGE des deux mélanges de transcription est indiquée. Des bandes de transcriptions précurseurs (avant clivage), pleine longueur ARNt et marteaux ribozyme deviennent visibles que des ombres, car ils empêchent la lumière UV d'atteindre la plaque de CCM fluorescentes. Total des ARNt de E. coli est utilisé comme marqueur de taille.
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Discussion
Dans cette présentation, nous avons illustré la façon de préparer des composants actifs pour la mesure de l'ARNt activité méthyltransférase de E. histolytica Ehmeth enzyme. Cette procédure peut servir comme point de départ et d'être facilement adapté à la mesure de l'ARNt méthyltransférases d'autres. Il est important de suivre les procédures qui permettent de préserver la qualité et l'intégrité du substrat ARNt et de l'ARNt méthyltransférase protéines pour assurer une mesure optimale de l'activité enzymatique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation d'Israël et de l'Institut des sciences familiales Rappaport pour la recherche en sciences médicales, et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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