Transfecting mänskliga neurala stamceller med Amaxa Nucleofector
Summary
Införandet av en gen av intresse i en cell är en kraftfull metod för att belysa dess funktion in vivo. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för transfecting en kultur för mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) med hjälp av Nucleofector elektroporation apparaten från Amaxa.
Abstract
Transfektion av primär däggdjur neurala celler, såsom mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), med vanliga katjoniska reagenser lipid transfektion har ofta resulterat i dålig cellviabiliteten och låg transfektion effektivitet. Andra mekaniska metoder för att införa en gen, till exempel en gen pistol eller mikroinjektion, begränsas också av dålig cellviabiliteten och lågt antal transfekterade cellerna. Strategin att använda virala konstruktioner att införa en exogen genen i galvaniska element har begränsade av både tid och arbete som krävs för att skapa virala vektorer och potentiella säkerhetsproblem. Vi beskriver här en steg-för-steg-protokoll för transfecting hNSPCs använda Amaxa är Nucleofector enhet och teknik med elektrisk ström parametrar och lösningar buffert speciellt optimerad för transfecting neurala stamceller. Användning av detta protokoll, har vi uppnått första transfektion effektivitet på ~ 35% och ~ 70% efter en stabil transfektion. Protokollet innebär att kombinera ett stort antal hNSPCs med DNA ska transfekterade i lämplig buffert följt av elektroporation med Nucleofector enheten.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver en relativt snabb och effektiv transfektion förfarande för hNSPCs. Med hjälp av denna procedur har vi fått första transfektion effektivitet på ~ 35%. Celler transfekterade genom detta förfarande kan användas för korttidsstudier (övergående transfekterade celler) eller för långsiktiga studier om ett urval medel används för att generera ett stabilt transfekterade befolkning. Vi har genererat stabilt transfekterade celler där ~ 70% av cellerna uttrycker exogent protein. I övergående transfekterade hN…
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs på Barnens s Hospital, Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPC kulturer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
