Summary
神経成長円錐におけるF -アクチン有刺鉄線両端を視覚化し、定量化する方法が記載されている。ガラス製カバースリップ上で培養ニューロン後、細胞をサポニン含有溶液に透過処理されています。その後、ローダミン-アクチンを含むサポニンバッファと短いインキュベーションは無料アクチン有刺鉄線端上に蛍光アクチンを内蔵しています。
Abstract
成長する軸索の運動性のヒントは、成長円錐と呼ばれています。成長円錐は、成長円錐の受容体に結合し、ダイナミクスと成長円錐細胞骨格3-6の組織を制御するローカルで表される分子指導の手がかりとの相互作用によって開発組織を通じて軸索をナビゲートつながる。これらのナビゲーション信号の主な目標は、継続的なアクチンの重合と動的な改造7まで成長円錐の外周部とそのドライブの成長円錐の運動性を満たすアクチンフィラメントの網細工です。正または魅力的な指導の手がかりは、刺激アクチンフィラメント（F -アクチン）誘引キューのソース近いです成長円錐の周辺の地域における重合によって回転成長円錐を誘発する。このアクチンの重合は、主要なマージンと誘引に向かって軸索伸長のローカル成長円錐の突起、付着を駆動します。
アクチンフィラメントの重合は、十分なアクチンの単量体の可用性にし、モノマーの添加のための重合核やアクチンフィラメント有刺鉄線端に依存します。アクチン単量体はニワトリ網膜および後根神経節（DRG）成長円錐における豊富に入手可能です。無料のF -アクチン有刺鉄線両端がモノマーの添加のために利用可能になった場合、その結果、重合が急速に増大する。これはひよこDRGと誘引80から10に近い成長円錐の領域でのF -アクチン切断するタンパク質のアクチン脱重合因子（ADF /コフィリン）の局所活性化を介して網膜成長円錐で発生します。この強化されたADF /コフィリンの活性は、重合のための新しいF -アクチン有刺鉄線両端を作成するためにアクチンフィラメントを切断。次のメソッドは、このメカニズムを示しています。 F -アクチンの合計含有量は、蛍光ファロイジンで染色して可視化される。 F -アクチンとげがある両端が他の運動性の細胞が11、12の以前の研究から適応され、以下で説明する手順で透過処理される成長円錐内にローダミン-アクチンの取り込みにより可視化。ローダミン-アクチンはとげがある両端にアクチン単量体の付加のための臨界濃度以上の濃度で添加されている場合、ローダミン-アクチンは、無料のタケノコの端の上に組み立てます。魅力的な合図がそのような成長円錐の片側に位置し、マイクロピペットから放出されるものとして、勾配で提示されている場合は、F -アクチン上にローダミン-アクチンの取り込みは、とげの端は、マイクロピペット10に向けて成長円錐の側に大きくなる。
成長円錐は、小さくて繊細なセル構造です。透過、ローダミン-アクチン取り込み、固定および蛍光可視化の手順はすべて慎重に行われており、倒立顕微鏡のステージ上で行うことができる。これらのメソッドは、移行するニューロン、他の主要な組織の細胞または細胞株におけるローカルアクチンの重合を研究に適用することができます。
Protocol
ローダミン-アクチンの標識のため、神経細胞は35mmプラスチック皿の底に置かれたガラス製カバースリップ上で、または"ビデオ"皿に接着されたカバースリップ上で培養されています。
1。カバースリップまたは"ビデオ"料理の準備
- 多くの神経細胞の種類は 、in vitro基質のに不十分な接着剤です。それらは十分に洗浄し、準備ができていない限り、この手順に必要なガラス製カバースリップは、十分なニューロン基板の密着性を許可しないことがあります。カバーガラスを洗浄し、洗浄酸の詳細な手順は、バンカーとゴズリンによって編集された書籍の培養神経細胞に記載されている。また、熱心に基質分子を結合するカバーガラス、、のためのニトロセルロースコーティングは、手順1.7と下記の1.8で説明されています。
- ガラスカバースリップ（例：18mmの正方形または24ミリメートル丸は）のdH 2 Oで洗浄し、有機の痕跡を除去するために乾熱可能な限り（≥225 ° C）のような長い（数日の最低3ヶ月以上の）で焼いています化合物。 1.6または1.3に進みますビデオの料理用に進みます。
- 高解像度のビデオ顕微鏡のための薄い透明なガラス基板を作成するには、適切な直径の円形の穴は電気コルクボーラーを（または類似の楽器）を使用して35または50 mmのプラスチックシャーレまたは組織培養皿の底に掘削されています。掘削は、プラスチックの割れを避けるために光の圧力で徐々に行われます。ドリル穴のエッジは両側の滑らかな表面を作成するためにハサミで掻き取りされています。
- 1.1または1.2で説明したようにガラス製カバースリップは、組織培養の使用のためにクリーンアップされます。カバーガラスは、非毒性のシリコン水族館のセメントを（18x18mmカバースリップのために、直径12 mmのビットが使用されている）を使用して、穴の上に接着されています。セメントは、24時間硬化させる。
- （次の手順は、滅菌条件を使用して行われている）ビデオの料理は、無菌のdH 2 Oで3回リンスし、空気乾燥されている。
- カバースリップは神経培養用基質分子でコーティングされています。最初に、カバースリップの表面は、加湿38℃インキュベーターで4〜8時間のPBSで100μg/ mlのポリ- D -リジンの（18 × 18カバースリップの250μL）溶液（または一晩）で被覆されている。カバースリップは、ポリ- D -リジン結合していないを削除するには無菌のdH 2 Oで3回洗浄し空気乾燥を許可されます。血清タンパク質が培養培地中に含まれている場合、多くの神経細胞のタイプは、単独でポリ- D -リジンでコートしたカバースリップ上で培養されています。しかしながら、in vivo条件での、より関連性の高い結果が天然基質の分子を使用することによって得られる。このようなラミニン、フィブロネクチンまたはL1 CAM（PBS中10から20μg/ mLの）として、これらの分子の溶液、、直接、4月8日時間または一晩ポリ- D -リジンコートしたカバースリップに適用することができますが、私たちの研究室で我々は日常的にコートタンパク質 - 基質結合を高めるために細胞接着分子を適用する前に、ニトロセルロースの薄膜を準備カバースリップ。
- 100パーセント酢酸アミル5mLに5gのニトロセルロースを溶解することにより1％のニトロセルロースのソリューションを行います。カバースリップにこの溶液を10μLを適用し、軽く表面の上に広がる。空気乾燥10分。
- 25μg/ mLのラミニンまたはPBS中4μg/ mLのL1 CAMのソリューションの250μLを適用し、ニトロセルロースの表面に広がる。加湿38℃インキュベーター、吸引基板で4時間（または一晩）インキュベートし、直ちに培養液を追加し、基質が乾燥しないように。
2。ニューロン培養の準備
- 胚7日目のニワトリ胚は、卵から削除し、実体顕微鏡を用いて、胸部と腹部から内臓を除去するために解剖のための10％血清を含む培養液を含む100mMのペトリ皿に配置されます。
- 胚は、その後、培地で洗浄し、液体培地で60 mmのシャーレに移し、さらに後根神経節（DRG）や神経網膜組織の外植片を除去し、準備に解剖されています。細胞生物学者のための方法とその応用、ホーとBamburgによって編集：詳細な解剖の説明は、細胞生物学、ボリューム71、ニューロン内のメソッドで見つけることができます。 DRGの外植片は1/2-whole神経節であり、神経網膜外植片は、直径1mm以下です。
- 無関係な組織の外植片を洗浄した後、個々の外植片を培養液と培養皿に既に登録されているカバーガラス、へ時計ピンセットで移動されます。解剖顕微鏡下では、外植片を静かにインキュベーターに搬送しながら動きを防ぐために、ピンセットでカバーグラスの中央に押されている。外植片をpH7.4〜10mMのHEPESで緩衝し、加湿38℃インキュベーターで一晩置くB27添加物、とF12培地中で培養されています。必要に応じて増殖因子を培地に、、追加することができます。 E7 DRGニューロンが追加されたニューロトロフィンなしで外植片からの軸索を延長するものの、神経栄養因子は多くの場合、以前の胚から培養液を、DRGに追加されます。神経網膜の外植片はせずに、この培養液中に軸索を延長成長因子を微か。
- 培養は、以下の手順を開始する前に、十分な軸索伸長を可能にするために少なくとも18時間インキュベートされています。
3。ローダミン-アクチンの透過処理バッファーの調製
- 138 mMのKCl、10mMのPIPES、3mMのEGTA、4mmのMgCl 2、及び1％BSA（pH値= 6.9）を含む透過バッファーのストック溶液は4 ° C11で2週間の状態に保つことができます。使用直前に、次のコンポーネントは、最終濃度が追加されています：0.025％サポニン、0.1mMのATP、および100nMアレクサ - フルオロ350ファロイジンを。
- 別々のソリューションはまた、新鮮な解決策が交互にボルテックスとtritratedローダミン-アクチンの塊を溶解するために5分間、および初期の透過化の段階で1分間攪拌されているだけでこれらの同じコンポーネントに加え、0.45μMローダミン非筋アクチンと一緒に使用する前に用意されていますチューブの重合を防止する。このにもかかわらず、真空管のフィラメントアセンブリは問題が残っている場合、ソリューションは、使用前に遠心分離することができます。
4。 F -アクチンばら両端上にローダミン-アクチンのニューロン培養及び定款の透過化
- DRGや網膜片培養皿は、慎重にインキュベーターから削除され、次の手順は室温で行っています。
- ソリューションのすべての変更は慎重に行う必要があります。ピペットチップは、カバースリップの端に配置し、ソリューションが削除され、ゆっくりと最小限の力で追加する必要があります。
- 培地を注意深くピペットで除去され、しかし着実に、そして細胞をカバーするのに十分な透過処理バッファーを1分（18ミリメートルXの18ミリメートルカバーするため、〜60μL）に追加されます。培養は、透過のバッファを追加する前に、他のソリューションで洗浄されていない、とカバーガラスは透過のバッファを追加する前に乾燥させることはできません。
- 透過バッファはピペットで除去し、4分間、0.45μmのローダミン非筋アクチンを含む細胞膜透過バッファに置き換えられます。
- ローダミン-アクチンを含む緩衝液は、ピペットにより除去され、神経細胞を4％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝液で作られた実験室グレードの、、pHは7.3）、0.05％のグルタルアルデヒドと10％ショ糖の溶液を添加することによって修正されています。 5分固定後、カバースリップを静かにPBSで洗浄され、そして3インチのスライドガラス上にSlowfadeにマウント。
- 変化するソリューションに代わるアプローチは、フローセルを使用することです。これは市販のフローセル、または単純なフローセルはカバースリップの四隅にスペーサとして、プラスチックの小片（厚さ≤1 mm）を配置することによってなされ、その後の上に同じサイズのカバースリップをマウントすることができますすることができますカバースリップ。ソリューションは、フローセルの一方の側でピペットを置き、他の側の芯（綿またはキムワイプ）で解を取り出すことにより交換することができる。
- F -アクチン鉄条網が終了し、成長円錐におけるF -アクチンの蛍光ファロイジンラベル上にローダミン-アクチンの取り込みは、60X油浸対物レンズを介してエピ蛍光光学系と可視化、および画像は冷却CCDカメラを使用して、収集されます。共焦点顕微鏡は、改良された撮像を提供することがあります。
- ローダミン-アクチン混入の最良の定量化のためにすべての画像は各画像のデジタルカメラの感度の同じゲインと露出の設定を使用して、単一のセッションで収集する必要があります。ラベリングの解析は、各画像の同等の領域から行う必要があります。Metamorph、画像Jや画像解析のための類似のコンピュータ化されたツールを使用することができます。
この手順のバリエーション
5。バリエーションOne：ローダミン-アクチンラベリングする前に生細胞の画像を収集
- ビデオの料理は温めた顕微鏡ステージ上に配置され、そしてライブ成長円錐の画像が収集されます。グリッド化されたカバーガラスカバースリップ上および/またはペンのマーキングを使用する、またはエッチングすることができますが、より簡単にラベルの後に特定のセルを見つけるために行うことができます、またはビデオの料理は、手続きの期間中、顕微鏡のステージ上の所定位置に固定することができます。
- 透過性、ローダミン-アクチンの取り込み、および細胞の固定は、顕微鏡ステージ上またはオフのどちらか、ビデオの皿の中で行われている。固定後、PBSを直接イメージングするためのビデオの皿に追加されます。後でイメージングのためのサンプルを保持するには、slowfade封入剤は、カバースリップに追加され、同じサイズのカバースリップを静かに（泡を避けること）上に配置され、エッジは、透明なマニキュアで密封されています。
6。バリエーション2：共同ラベル追加のタンパク質の免疫化学
- （4.2から4.4まで）上記のようなローダミン-アクチンの取り込みや固定は、カバースリップ上またはビデオの皿で培養したニューロンを行うことができる。
- 固定後、およびPBSでの洗浄、細胞をPBS中の0.1 Mグリシン、15分を処理し、次にで抽出されている0.1％のTriton X - 100で1時間、2％ヤギ血清および1％BSAを含むPBSで（TX - 100）カバースリップ1時間1％BSAを含むPBSで希釈した一次抗体とインキュベートされていますカバーガラスは、その後1時間、1％BSAを含むPBSで1:1000に希釈して蛍光二次抗体を適用する前に、2％ヤギ血清と1時間、1％BSAを含むPBSでTX - 100をリンスし、0.1％でインキュベートする洗浄後、カバースリップを再び、30分間、2％ヤギ血清および1％BSA、0.1％PBSでTX - 100でインキュベートリンスし、そして抗退色培地でマウントされます。いくつかのタンパク質の局在は、初期の透過性のステップ（4.3）によって破壊される。抗体を用いた多言語対応、0.05％のパラホルムアルデヒドおよび0.05％のグルタルアルデヒドのためにこれらのタンパク質を保持することはローダミン-アクチンで鉄条網末端標識に影響を与えずに（ローダミン-アクチンを追加する前に、すなわち）、1分間透過化バッファに追加することができます。
- 三重標識成長円錐の画像は、蛍光または共焦点顕微鏡によって収集されます。
7。バリエーション3：F -アクチンフリーばら両端の指導の手がかりの効果の評価
- 成長因子や指導のキューは、インキュベータから皿を削除し、透過処理の手順を開始する前に、数分間には、いくつかのng / mLの（または適切な治療の時間）の濃度のインキュベーターで培養皿に追加されます。これは、F -アクチンフリー有刺鉄線両端の成長因子や指導の手がかりの短期的な影響の評価を可能にする。
- ニューロン培養とビデオの皿は、温められた顕微鏡ステージ上に配置することができ、成長因子や指導の手がかりは、透過とローダミン-アクチンの取り込みを開始する前に、成長円錐に近い勾配でマイクロピペットから放出させることができる。例えば、NGFは神経網膜神経節細胞のために神経細胞やネトリンをDRGの解放することができます。ピペットは、透過処理の手順を開始する前に1〜2分ほど短いために導入することができる。これは、マージンをリードする成長円錐でのF -アクチンフリー有刺鉄線端の形成に関する指導のキューの勾配（画像の参照引用10を参照）の局所的な影響の評価を可能にする。
- これらのバリエーションは、上記6.2で説明した他の神経成分の抗体媒介性ラベリング、と組み合わせることができます。
8。バリエーションフォー：トランスフェクションニューロンのF -アクチンフリーバーブ末端標識
- RNAiを（蛍光識別するマーカー付き）を使用して恒常的に活性またはドミナントネガティブな構造またはタンパク質のノックダウンの使用は、F -アクチンフリー有刺鉄線両端を調節するタンパク質の関与を評価するために使用することができます。成長円錐内でのタンパク質、その局在に応じて、それが蛍光タグに融合されている場合、トランスフェクションされた細胞の蛍光発現したタンパク質が透過化によって失われる可能性があります。このような場合は、ビデオの皿を顕微鏡透過化の前にトランスフェクトされた細胞を識別するために使用することができる、と透過をトランスフェクトした細胞の位置をマーキングした後、顕微鏡ステージ上で実行することができます。また、GFP -アクチン構造は、興味の構築- GFPでコトランスフェクションすることができます。このケースでは、GFP -アクチンは、F -アクチンに組み込まれる予定、および透過後にトランスフェクトされた細胞の同定を可能にする、透過化によって失われることはありません。
- この変化は、上記7.1から7.3で説明したように、指導の手がかりを追加して組み合わせることができます。
9。代表的な結果
図1。 NGFのグローバルさらには、DRG成長円錐は、5分間の神経成長因子（NGF）で刺激されると、アクチンの重合がリードマージンで刺激される。総数、F -アクチンと成長円錐をリードマージンでのF -アクチンとげのある端を増加し、ローダミン-アクチンのラベリングの明るいバンドが成長円錐の周辺部に見られている。図1は、非刺激DRGの成長円錐にローダミン-アクチンの取り込みを比較し、成長円錐をDRGのNGF刺激。マージされた画像の緑色の蛍光は、成長円錐でのF -アクチンのファロイジンのラベルであり、赤色がローダミン-アクチンの標識です。とげのある末端標識のための良好な制御は、ステップ4.2と4.3での透過バッファに10-6 M以上のサイトカラシンBまたはDを追加することです。 CytochalasinsキャップF -アクチン鉄条網の端とバーブ端に結合するローダミン-アクチンを阻害する。これは深刻な細胞内にローダミン-アクチンの取り込みを軽減または排除する必要があります。スケールバーは、10μmである。
図2。 NGF勾配が局所的にF -アクチンとげのある端を増加させる。リリースNGFは、F -アクチンの自由なとげのある端を標識することによって続いて2分間DRG成長円錐の片側になっていることをマイクロピペットで。以下の画像は、NGFの勾配をローカルに近いピペットに成長円錐の地域でF -アクチンフリー有刺鉄線両端の増加を刺激への曝露を示す。マージされた画像は、緑のファロイジンを示しています。と赤色のローダミン-アクチン。スケールバーは10μm。
図3。活性化ERMタンパク質は、成長円錐をリードマージンで蓄積されます。phospho-Ezrin/Radixin/Moesinの免疫細胞化学的ラベリング（PERM）をF -アクチンフリー有刺鉄線で終わります。グルタルアルデヒド（0.05％）とパラホルムアルデヒド（0.05％）がERMの局在を維持するために1分間の初期透過化バッファに追加されました。ローダミン-アクチン、赤、PERM、緑、ファロイジン、青。スケールバーは10μm。
図4。アクチンの重合の刺激は、アクティブなERM蛋白質が必要です。解離DRGSは、GFP -アクチンとGFPコントロールプラスミドまたはドミナントネガティブエズリン/ラディキシン/モエシン（DN ERMは）コンストラクトでコトランスフェクションした。 GFP -アクチンを使用すると、透過した後、トランスフェクションされた細胞の同定が可能になります。ここでは、NGFは、前のF -アクチン鉄条網の端の標識に5分を追加しました。 DN ERMをトランスフェクトした成長円錐が近くにトランスフェクトされていない成長円錐（下パネル）を持つ、またはGFPコントロール（上段中央のパネル）と対照的成長円錐リーディングマージン（下側中央のパネル）、で、鉄条網の端のレベルを減少しているに注意してください。ローダミン-アクチン、赤、GFP -アクチン、緑。スケールバーは、10μmである。
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Discussion
メソッドは、成長円錐の移行の主要なマージンにおけるアクチン細胞骨格の動的変化に関与する細胞成分の時間的および空間分解能を可能にするここで紹介。急速にアクチンフィラメントの重合を促進するNGFまたはネトリンのような誘引分子の作用は、図1及び図2に示すように活性化されたADF /コフィリン10でアクチンフィラメント切断によって作成されたアクチンとげが終了、、で地元の増加として明らかにされます。メソッドは、ラディキシン、図3と図4に描かERMタンパク質、などの成長円錐chemotropic応答を、媒介に関与する他のタンパク質の局在化を可能にします。これらのメソッドは、移行するニューロン、グリア細胞または他の細胞型においてアクチンに基づく運動の調節を分析するために適用することができます。
成長円錐または他の小さな運動性の構造の微妙な性質は、このメソッドの使用の大幅な制限です。成長円錐リーディングマージンまたはセルの類似した運動性の領域は、アクチンフィラメントと形質膜以外のいくつかの構造的な要素が含まれているので、一歩ごとに注意する必要があります。ソリューションが交換されるため、細胞の凝集や植は、表面張力の変化によって破壊されることがあります。プロトコルで述べたように、それは解決策を変更するためのカバースリップの端にピペットを配置することをお勧め、とフローセルを使用すると、表面張力の問題を削除してしまうことになります。
細胞の運動性の領域でアクチンとげのある端を可視化するための代替手段として、このようなしかし恵那/ VASPやミオシンXのようなとげがあるエンド結合タンパク質の蛍光類似体を、表現する細胞のトランスフェクションを含む、成長円錐の余白にアクチンダイナミクスは、無秩序な発現によって変更される場合がありますこれらのアクチン調節タンパク質の。
葉状仮足があるように糸状仮足は、強くこのローダミン-アクチンの標識法により標識されていません。それらが透過バッファに格納されている蛍光ファロイジンで標識して安定化されているものの、糸状仮足は、中断される可能性があります。ローダミン-アクチンのlamellipodial VS filopodial定款でこの違いは、組み込まれたローダミン-アクチンの可視化の定量的な制限を反映しているかもしれない、またはこれらの運動性の構造にタンパク質をキャッピング有刺鉄線エンドの存在下で違いがあるかもしれない。これは、この方法で無料タケノコ両端のラベルは、そのようなF -アクチンのADF /コフィリン切断することによりとして、ラベルが付いた有刺鉄線両端が新たに作成されているかどうかを明らかにしないという追加の制限が発生、または、F -アクチンは切断がとげが終了されていないかどうかタンパク質をキャッピング有刺鉄線終わりの除去によって解放されます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、博士はジェームズBamburgとこれらの研究におけるコラボレーションのための彼の研究室のメンバーに感謝。この作品は、NIHの助成金HD19950、EY07133で、ミネソタ医学財団からの補助金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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