Summary
Een methode om te visualiseren en te kwantificeren F-actine weerhaken eindigt in neuronale groei kegels wordt beschreven. Na het kweken neuronen op glas dekglaasjes worden cellen gepermeabiliseerd met een saponine-bevattende oplossing. Dan, een korte incubatie met de saponine buffer met rhodamine-actine bevat fluorescerende actine op gratis actine prikkeldraad eindigt.
Abstract
De beweeglijke uiteinden van de groeiende axonen worden genoemd groei kegels. Groei kegels leiden navigeren axonen door het ontwikkelen van weefsels door interactie met lokaal uitgedrukt moleculaire begeleiding signalen dat de groei kegel-receptoren binden en reguleren van de dynamiek en de organisatie van de groei kegel cytoskelet 3-6. Het voornaamste doel van deze navigatie-signalen is het actine filament meshwork dat de groei kegel periferie en dat drijft de groei conus beweeglijkheid door middel van voortdurende actine polymerisatie en dynamische remodeling 7 vult. Positief of aantrekkelijk begeleiding signalen veroorzaken de groei kegel te draaien door het stimuleren van actine filament (F-actine) polymerisatie in de regio van de groei kegel periferie, dat is dichter bij de bron van de lokstof cue. Deze actine polymerisatie drijft lokale groeikegel uitsteken, hechting van de toonaangevende marge en axonale rek in de richting van de lokstof.
Actinefilamenten polymerisatie is afhankelijk van de beschikbaarheid van voldoende actine monomeer en op de polymerisatie kernen of actine filament prikkeldraad eindigt voor de toevoeging van monomeer. Actine monomeer is overvloedig aanwezig in de kuiken het netvlies en de dorsale wortel ganglion (DRG) groei kegels. Bijgevolg, polymerisatie neemt snel toe als free F-actine prikkeldraad eindigt beschikbaar komen voor monomeer toevoeging. Dit gebeurt in het kuiken DRG en retinale groei kegels via de lokale activering van de F-actine verbreken eiwit actine depolymerizing factor (ADF / cofilin) in de groeikegel regio dichter bij een attractant 8-10. Deze verhoogde ADF / cofilin activiteit Severs actine filamenten het creëren van nieuwe F-actine weerhaken uiteinden voor polymerisatie. De volgende methode demonstreert dit mechanisme. Totale gehalte aan F-actine wordt gevisualiseerd door kleuring met fluorescerende phalloidin. F-actine weerhaken uiteinden zijn gevisualiseerd door de incorporatie van rhodamine-actine in groei kegels die gepermeabiliseerd met de procedure beschreven in het volgende, dat is een bewerking van eerdere studies van andere beweeglijke cellen 11, 12. Wanneer rhodamine-actine wordt toegevoegd bij een concentratie boven de kritische concentratie voor actine monomeer naast prikkeldraad eindigt, rhodamine-actine monteert op gratis prikkeldraad eindigt. Als de aantrekkelijke cue wordt gepresenteerd in een verloop, zoals het vrijkomen van een micropipet geplaatst aan een kant van een groei kegel, zal de integratie van rhodamine-actine op F-actine prikkeldraad eindigt groter zijn in de groei kegel kant in de richting van de micropipet 10 .
De groei kegels zijn klein en delicaat celstructuren. De procedures van permeabilisatie, rhodamine-actine oprichting, fixatie en fluorescentie visualisatie zijn allemaal zorgvuldig gebeuren en kan worden uitgevoerd op het podium van een omgekeerde microscoop. Deze methoden kunnen worden toegepast op het bestuderen van de lokale actine polymerisatie bij het migreren van neuronen, andere primaire weefsels cellen of cellijnen.
Protocol
Voor rhodamine-actine labeling, zijn neuronen gekweekt op glas dekglaasjes geplaatst in de bodem van 35 mm plastic borden, of op dekglaasjes gelijmd in "video" gerechten.
1. Voorbereiding van Dekglaasjes of "Video" Dishes
- Veel soorten neuronale slecht lijm aan in vitro substraten. Dekglaasjes, die nodig zijn voor deze procedure, kan niet toestaan dat voldoende neuron-substraat adhesie, tenzij ze voldoende wordt gereinigd en voorbereid. Een gedetailleerde procedure voor zure wassen en reinigen van glas dekglaasjes wordt beschreven in het boek Het kweken van zenuwcellen, onder redactie van Banker en Goslin. Als alternatief is een nitrocellulose coating voor dekglaasjes, die gretig bindt substraat moleculen, beschreven in stap 1.7 en 1.8 hieronder.
- Glas dekglaasjes (bijv. 18 mm vierkanten of cirkels 24 mm) zijn gespoeld in dH 2 O en gebakken in droge warmte (≥ 225 ° C) zo lang mogelijk (minimaal enkele dagen tot drie maanden of langer) om sporen van organisch te verwijderen verbindingen. Ga naar de 1.6 of voor video-gerechten gaat u verder met stap 1.3.
- Voor het maken van een dunne heldere glazen substraat voor hoge resolutie videomicroscopy, zijn ronde gaten van de juiste diameter geboord in de bodem van 35 of 50 mm plastic Petri of weefselkweek gerechten met een elektrische kurkboor (of vergelijkbaar instrument). Boren is langzaam gedaan met lichte druk om te voorkomen dat het kraken van de kunststof. Randen van het boorgat worden afgeschraapt met een schaar tot een glad oppervlak aan beide zijden te creëren.
- Dekglaasjes worden gereinigd voor weefselkweek te gebruiken, zoals beschreven in 1.1 of 1.2. Coverslips worden gelijmd in plaats over de gaten, met behulp van niet-giftige siliconen aquarium cement (voor 18x18mm dekglaasjes, een 12mm diameter bit wordt gebruikt). Het cement is uitgehard gedurende 24 uur.
- (De volgende stappen zijn gedaan met behulp van steriele omstandigheden) De video gerechten worden gespoeld drie keer met steriel dH 2 O en liet aan de lucht drogen.
- Coverslips zijn gecoat met substraat moleculen voor neuronale cultuur. Eerst wordt het dekglaasje oppervlak bedekt met (250 il voor 18x18 dekglaasje) een oplossing van 100 ug / ml poly-D-lysine in PBS voor 4-8 uur (of 's nachts) in een vochtige 38 ° C incubator. Coverslips worden vervolgens gespoeld drie keer met steriel dH 2 O om ongebonden te verwijderen poly-D-lysine en liet aan de lucht drogen. Veel neuronale soorten zijn gekweekt op dekglaasjes bekleed met poly-D-lysine alleen, als serum-eiwitten zijn opgenomen in het kweekmedium. Echter, de resultaten meer relevant zijn voor in vivo omstandigheden worden verkregen door het gebruik van natuurlijke substraat moleculen. Oplossingen van deze moleculen, zoals laminine, fibronectine of L1 CAM (1-20 ug / ml in PBS), direct kunnen worden toegepast op poly-D-lysine beklede dekglaasjes voor 4-8 uur of 's nachts, maar in ons lab hebben we regelmatig de vacht van de voorbereide dekglaasjes met een dunne film van nitrocellulose voordat celadhesiemoleculen naar eiwit-substraat binding te vergroten.
- Maak een 1% nitrocellulose-oplossing door het oplossen van 5 g nitrocellulose in 5 ml 100% amylacetaat. Van toepassing zijn 10 pi van deze oplossing voor het dekglaasje en voorzichtig spreid het over het oppervlak. Drogen aan de lucht 10 minuten.
- Breng 250 pi van een oplossing van 25 ug / ml laminine of 4 ng / mL L1 CAM in PBS en verspreid over de nitrocellulose oppervlak. Incubeer 4 uur (of nacht) in een vochtige 38 ° C incubator, aspireren substraat en voeg onmiddellijk kweekmedium, zodat de ondergrond niet droog.
2. De voorbereiding van neuronale culturen
- Embryonale dag 7 kippenembryo's worden verwijderd uit eieren, en geplaatst in 100 mm platen met kweekmedium met 10% serum voor dissectie om de interne organen van de thorax en de buik te verwijderen, met behulp van een stereomicroscoop.
- De embryo's worden vervolgens gespoeld met medium en verhuisde naar een 60 mm schotel met vloeibaar medium en verder ontleed te verwijderen en voor te bereiden explantaten van achterwortelganglia (DRG) of neurale netvlies weefsels. Een gedetailleerde dissectie beschrijving is te vinden in Methods in Cell Biology, volume 71, Neuronen: methoden en toepassingen voor de Celbiologe, bewerkt door Hollenbeck en Bamburg. DRG explantaten zijn 1/2-whole ganglia en neurale netvlies explantaten zijn 1 mm of minder in diameter.
- Na het reinigen van de explantaten van vreemde weefsels, zijn individuele explantaten verhuisde met horlogemakers pincet om de dekglaasjes, die reeds in de cultuur gerechten met het kweekmedium. Onder een microscoop ontleden, is het explantatie voorzichtig ingedrukt om het centrum van het dekglaasje met een tang om beweging te voorkomen, terwijl het transport naar de incubator. Explantaten worden gekweekt in F12 medium met B27 additieven, gebufferd met 10 mM HEPES tot pH 7,4 en overnachting in een vochtige 38 ° C incubator. Groeifactoren kunnen worden toegevoegd, indien nodig, aan het kweekmedium. Neurotrofinen worden vaak toegevoegd aan DRG culturen uit oude embryo's, hoewel E7 DRG neuronen zal axonen strekken zich uit explantaten zonder toegevoegde neurotrofinen. Explantaten van neurale netvlies te breiden axonen in deze cultuur medium zonder eendding groeifactoren.
- Culturen zijn geïncubeerd gedurende tenminste 18 uren om voldoende axonale uitgroei mogelijk te maken vóór het begin van de onderstaande procedure.
3. Voorbereiding van Rhodamine-actine permeabilisatie Buffer
- Een voorraad oplossing van permeabilisatie buffer die 138 mM KCl, 10 mm buizen, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2, en 1% BSA (pH = 6,9) gehouden kan worden tot 2 weken bij 4 ° C11. Net voor gebruik, worden de volgende componenten toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van: 0,025% saponine, 0,1 mM ATP, en 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin.
- Een aparte oplossing is ook vers bereid vlak voor gebruik met dezelfde componenten plus 0.45μM rhodamine non-muscle actine De oplossing is afwisselend gevortext en tritrated gedurende 5 min tot rhodamine-actine klonten te ontbinden, en is gevortexed gedurende 1 minuut in de eerste permeabilisatie stap om te voorkomen dat polymerisatie in de buis. Mochten er ondanks deze, filament montage in de buis blijft een probleem, kan de oplossing worden vóór gecentrifugeerd om te gebruiken.
4. Permeabilisatie van neuronale culturen en Integratie van Rhodamine-actine op F-actine Barbed Ends
- Een cultuur schotel met DRG of retinale explantaten is zorgvuldig verwijderd uit de incubator en de volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Alle wijzigingen van de oplossingen moeten zorgvuldig worden gedaan. De pipetpunt moet worden geplaatst aan de rand van het dekglaasje, en oplossingen moeten worden verwijderd en toegevoegd langzaam en met minimale kracht.
- Het kweekmedium wordt verwijderd met een pipet voorzichtig, maar gestaag, en genoeg permeabilisatie buffer om cellen te dekken is toegevoegd voor een min (voor 18mm x 18mm dekglaasje, ~ 60 pi). De cultuur is niet gespoeld met andere oplossingen voor het toevoegen van de permeabilisatie buffer, en het dekglaasje is niet toegestaan om te drogen voordat u de permeabilisatie buffer.
- De permeabilisatie buffer wordt voorzichtig verwijderd met een pipet en vervangen door de permeabilisatie buffer met 0,45 uM rhodamine non-muscle actine voor 4 minuten.
- De rhodamine-actine-bevattende buffer wordt voorzichtig verwijderd met een pipet, en de neuronen worden vastgesteld door het toevoegen van een oplossing van 4% paraformaldehyde (laboratorium kwaliteit, gemaakt met fosfaatbuffer, pH 7,3), 0,05% glutaaraldehyde en 10% sucrose. Na 5 minuten fixatie de dekglaasjes zijn voorzichtig gespoeld met PBS, en gemonteerd in Slowfade op 3-inch glazen dia's.
- Een alternatieve benadering op veranderende oplossingen is het gebruik van een flow cel. Dit kan een commercieel verkrijgbaar flow cel, of een simpele flow cel kan worden gemaakt door het plaatsen van kleine stukjes plastic (≤ 1 mm dik) als afstandhouders op de hoeken van het dekglaasje, en dan monteren een gelijke grootte dekglaasje op de top van de dekglaasje aan. Oplossingen kunnen worden uitgewisseld door het plaatsen van de pipet aan de ene kant van de stroom cel en intrekking van oplossingen met een lont (katoen of een Kimwipe), aan de andere kant.
- De integratie van rhodamine-actine op F-actine prikkeldraad eindigt en tl-phalloidin etikettering van F-actine in de groei kegels wordt gevisualiseerd met epi-fluorescentie optiek door middel van een 60X olie-immersie objectief, en de beelden worden verzameld met behulp van een gekoelde CCD-camera. Een confocale microscoop kan zorgen voor een betere beeldvorming.
- Voor de beste kwantificering van rhodamine-actine incorporatie alle afbeeldingen moet worden verzameld in een enkele sessie, met dezelfde gain en belichtingsinstellingen van de digitale camera de gevoeligheid voor elk beeld. Analyse van de etikettering moeten worden gemaakt van equivalente regio's van elk beeld, Metamorph, Image J of soortgelijke geautomatiseerde tools voor beeldanalyse kunnen worden gebruikt.
Variaties op dit PROCEDURE
5. Variatie One: Verzamel Live Cell beelden Voorafgaand aan Rhodamine-actine Etikettering
- Video gerechten zijn geplaatst op een verwarmde microscoop podium, en live groeikegel beelden zijn verzameld. Gerasterde coverslips kan worden gebruikt, of etsen en / of pen markeringen op het dekglaasje kan worden gemaakt om gemakkelijker specifieke cellen te vinden nadat de etikettering, of de video gerecht kan worden bevestigd op zijn plaats op de microscoop podium voor de duur van de procedure.
- Permeabilisatie, integratie van rhodamine-actine, en cel fixatie worden uitgevoerd in de video schotel, op of buiten de microscoop podium. Na de vaststelling wordt PBS toegevoegd aan de video-gerechten voor directe beeldvorming. Voor het behoud van de steekproef voor latere beeldvorming, is slowfade montage medium toegevoegd aan het dekglaasje en een dekglaasje van gelijke grootte is voorzichtig bovenaan geplaatst (het vermijden van luchtbellen), en de randen worden vervolgens afgedicht met heldere nagellak.
6. Variatie Twee: Immunochemie naar Co-label Extra eiwitten
- Rhodamine-actine oprichting en fixatie kan worden uitgevoerd op de neuronen gekweekt op dekglaasjes of in video gerechten, zoals hierboven beschreven (4,2 tot 4,4).
- Na fixatie, en spoelen in PBS, worden de cellen behandeld 15 min met 0,1 M glycine in PBS en daarna geëxtraheerd met 0,1% Triton X-100 (TX-100) in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 1 uur Coverslipsworden geïncubeerd met het primaire antilichamen verdund in PBS dat 1% BSA gedurende 1 uur De dekglaasjes worden vervolgens gespoeld en geïncubeerd in 0,1% TX-100 in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 1 uur, voor het aanbrengen van fluorescente secundaire antilichamen bij 1:1000 verdunning in PBS met 1% BSA gedurende 1 uur Na het spoelen, zijn de dekglaasjes opnieuw geïncubeerd in 0,1% TX-100 in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 30 minuten, gespoeld, en gemonteerd in anti-fading medium. De lokalisatie van sommige eiwitten wordt verstoord door de eerste permeabilisatie stap (4,3). Te behouden deze eiwitten voor de lokalisatie met antilichamen, 0,05% en 0,05% paraformaldehyde glutaaraldehyde kunnen worden toegevoegd aan de permeabilisatie buffer gedurende 1 min (dus vóór het toevoegen van de rhodamine-actine) zonder dat het prikkeldraad einde etiket door rhodamine-actine.
- Foto's van triple-gelabeld groei kegels zijn verzameld door fluorescentie of confocale microscopie.
7. Variatie Drie: Beoordeling van de effecten van Guidance Cues op F-actine Gratis Barbed Ends
- Een groeifactor of begeleiding cue wordt toegevoegd aan de cultuur gerechten in de couveuse bij concentraties van verschillende ng / ml voor een paar minuten (of een passende behandeling tijd) voordat u de schotel uit de incubator en het begin van de permeabilisatie procedure. Dit maakt de beoordeling van de korte-termijn effecten van groeifactoren of begeleiding aanwijzingen op de F-actine vrij prikkeldraad eindigt.
- Een video schotel met neuronale culturen kunnen worden geplaatst op een verwarmde microscoop podium, en groeifactoren of begeleiding signalen kunnen worden vrijgesteld van een micropipet in een gradiënt in de buurt van een groei kegel voor het begin van de permeabilisatie en rhodamine-actine oprichting. Kan bijvoorbeeld NGF worden vrijgegeven voor DRG neuronen of netrine voor neurale retinale ganglioncellen. De pipet kan worden ingevoerd voor zo kort 1-2 minuten voor het begin van het permeabilisatie procedure. Dit maakt de beoordeling van de lokale effecten van een begeleiding cue gradiënt op de vorming van de F-actine vrij weerhaken eindigt in groeikegel de grootste winstmarges (zie referentie citation 10 voor afbeeldingen).
- Deze variaties kunnen worden gecombineerd met antilichaam-gemedieerde etikettering van andere neuronale componenten, zoals beschreven in 6.2.
8. Variatie Vier: F-actine Gratis Prikkeldraad End Etikettering op Getransfecteerde Neuronen
- Het gebruik van constitutief actieve of dominante-negatief bouwt of proteïne knockdown met behulp van RNAi (met een fluorescerende identificeren marker) kan gebruikt worden om een eiwit betrokken bij het reguleren van F-actine vrij prikkeldraad eindigt beoordelen. Afhankelijk van het eiwit, de lokalisatie in de groei kegel, en als het is gefuseerd aan een fluorescerend label, het fluorescerende proteïne uitgedrukt in getransfecteerde cellen verloren kunnen gaan bij permeabilisatie. Als dit het geval is, kan video schotels worden gebruikt om een getransfecteerde cel te identificeren microscopisch voor permeabilisatie, en de permeabilisatie kan worden uitgevoerd op de microscoop podium, na het markeren van de positie van de getransfecteerde cellen. Als alternatief kan een GFP-actine construct als co-getransfecteerd met een GFP-construct van belang. In dit geval zal GFP-actine worden opgenomen in de F-actine, en zal niet verloren gaan door permeabilisatie, waardoor de identificatie van de getransfecteerde cellen na permeabilisatie.
- Deze variatie kan worden gecombineerd met de toevoeging van begeleiding signalen, zoals beschreven in 7.1-7.3 hierboven.
9. Representatieve resultaten
Figuur 1. Global toevoeging van NGF verhoogt de totale F-actine en F-actine prikkeldraad eindigt bij de groei kegel toonaangevende marge. Wanneer een DRG groeikegel wordt gestimuleerd met een zenuw groeifactor (NGF) gedurende 5 minuten, actine polymerisatie wordt gestimuleerd op de voorste rand, en een heldere band van rhodamine-actine-etikettering is gezien rond de groeikegel periferie. Figuur 1 vergelijkt rhodamine-actine-opname in een gestimuleerde DRG groeikegel en een NGF-gestimuleerde DRG groei kegel. De groene fluorescentie in de gefuseerde beelden is phalloidin etikettering voor F-actine in de groei kegel en de rode is rhodamine-actine-labeling. Een goede controle voor het prikkeldraad einde etikettering is tot 10-6 M of hoger cytochalasine B of D toe te voegen in de permeabilisatie buffer in stappen 4.2 en 4.3. Cytochalasins cap F-actine prikkeldraad eindigt en de remmen rhodamine-actine binden aan prikkeldraad eindigt. Dit moet drastisch verminderen of te elimineren integratie van rhodamine-actine in de cel. Schaal van bars, 10 urn.
Figuur 2. Een NGF gradiënt verhoogt lokaal F-actine prikkeldraad eindigt. Een micropipet die releases NGF is gebracht aan een kant van een DRG groeikegel gedurende 2 minuten, gevolgd door de etikettering van F-actine vrij prikkeldraad eindigt. De beelden hieronder laten zien dat blootstelling aan een helling van de NGF lokaal stimuleert een verhoging van de F-actine vrij weerhaken eindigt in de groei kegel regio dichter bij de pipet. De gefuseerde beeld toont phalloidin in het groenen rhodamine-actine in het rood. Schaalbalk, 10 urn.
Figuur 3. Geactiveerde ERM eiwitten zich ophopen aan de groei kegel toonaangevende marge. Immunocytochemische etikettering van phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) met F-actine vrij prikkeldraad eindigt. Gluteraldehyde (0,05%) en paraformaldehyde (0,05%) werden toegevoegd aan de eerste permeabilisatie buffer voor een min om ERM lokalisatie te behouden. Rhodamine-actine, rood, PERM, groen; phalloidin, blauw. Schaalbalk, 10 urn.
Figuur 4. Stimulatie van actine polymerisatie vereist een actieve ERM eiwitten. Gedissocieerd DRG's waren co-getransfecteerd met GFP-actine en een GFP controle plasmide of een dominant-negatief Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) te bouwen. Het gebruik van GFP-actine maakt de identificatie van de getransfecteerde cellen na permeabilisatie. Hier werd NGF toegevoegd 5 minuten voorafgaand aan de etikettering van F-actine prikkeldraad eindigt. Let op de groei kegel getransfecteerd met DN ERM heeft prikkeldraad einde niveaus gereduceerd aan de groei kegel toonaangevende marge (lagere middenklasse panel), die in schril contrast met een nabijgelegen ongetransfecteerde groeikegel (onderste panelen), of met de GFP controle (bovenste middelste paneel). Rhodamine-actine, rood; GFP-actine, groen. Schaal van bars, 10 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden die hier staat temporele en ruimtelijke resolutie van cellulaire componenten die in de dynamische verbouwing van het actine cytoskelet betrokken bij de toonaangevende marge van het migreren van de groei kegels. De actie van de lokstof moleculen, zoals NGF of netrine, om snel te stimuleren actine filament polymerisatie wordt onthuld als een lokale toename van de actine prikkeldraad eindigt, gecreëerd door actine filament verbreken door de activering van ADF / cofilin 10, zoals getoond in de figuren 1 en 2. De methode maakt lokalisatie van andere eiwitten die betrokken zijn bij de bemiddeling groeikegel chemotropic reacties, zoals radixin, een ERM-eiwit, afgebeeld in figuur 3 en 4. Deze methodes kunnen ook worden toegepast op de regulering van de op actine gebaseerde beweeglijkheid te analyseren bij het migreren van neuronen, gliacellen of andere celtypen.
De delicate aard van de groei kegels of andere kleine beweeglijke structuren is een belangrijke beperking in het gebruik van deze methode. Groeikegel de grootste winstmarges of vergelijkbare regio's van beweeglijke cellen bevatten enkele structurele andere elementen dan actine filamenten en de plasmamembraan, dus zorg moet worden genomen bij elke stap. Cel aggregaten of explantaten kan worden verstoord door veranderingen in de oppervlaktespanning, als oplossingen worden uitgewisseld. Zoals vermeld in het protocol, is het het beste om pipetten plaats aan de rand van dekglaasjes voor het veranderen van oplossingen en het gebruik van een flow cel zou de eliminatie van problemen van de oppervlakte spanningen.
Een alternatieve methode om actine weerhaken eindigt visualiseren beweeglijke delen van cellen gaat celtransfectie tot uitdrukking te brengen TL-analogen van weerhaken end-bindende eiwitten, zoals Ena / VASP of myosine X. Echter, actine dynamiek in de groei kegel marges veranderd worden door niet-gereguleerde expressie van deze actine regulerende eiwitten.
Filopodia zijn niet zo sterk gelabeld door deze rhodamine-actine labeling methode worden lamellipodia. De filopodia kan worden verstoord, hoewel ze worden gelabeld en gestabiliseerd door de tl-phalloidin in de permeabilisatie buffer. Dit verschil in lamellipodial vs filopodial integratie van rhodamine-actine zou kunnen wijzen op een kwantitatieve beperking in de visualisatie van de gebruikte rhodamine-actine, of er kan een verschil in de aanwezigheid van prikkeldraad einde aftopping eiwitten in deze beweeglijke structuren. Dit leidt tot een extra beperking dat de etikettering van de vrije prikkeldraad eindigt met deze methode niet uitwijzen of het label prikkeldraad eindigt pas worden gemaakt, zoals door ADF / cofilin verbreken van F-actine, of F-actine is niet verbroken, maar prikkeldraad eindigt zijn bevrijd door het verwijderen van prikkeldraad einde aftopping eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken dr. James Bamburg en leden van zijn laboratorium voor samenwerking in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie HD19950, EY07133 en door subsidies van de Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
