Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.
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Articolo metodologico
L'etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le punte mobili di assoni in crescita sono chiamati coni di crescita. Coni di crescita degli assoni conducono navigare attraverso i tessuti in via di sviluppo, interagendo con spunti a livello locale ha espresso la guida molecolare che si legano recettori cono di crescita e regolano le dinamiche e l'organizzazione del citoscheletro cono di crescita del 3-6. L'obiettivo principale di questi segnali di navigazione è il reticolo di filamenti di actina che riempie la periferia cono di crescita e che la crescita unità motilità del cono attraverso la polimerizzazione di actina e continuo rimodellamento dinamico 7. Spunti interessanti indicazioni positive o indurre il cono di crescita di svolta stimolando filamenti di actina (F-actina) polimerizzazione nella regione della periferia cono di crescita che è più vicino alla fonte della stecca attrattiva. Questa la polimerizzazione di actina unità locali cono di crescita sporgenza, l'adesione del margine di leader e di allungamento assonale verso l'attrattore.
Polimerizzazione filamento dipende dalla disponibilità di monomero di actina sufficiente e su nuclei di polimerizzazione o termina filamenti di actina spinato per l'aggiunta di monomero. Actina monomero è abbondantemente disponibile nel ganglio della radice pulcino della retina e dorsale (DRG) coni di crescita. Di conseguenza, polimerizzazione aumenta rapidamente quando libero F-actina finisce spinato diventano disponibili per oltre monomero. Ciò si verifica in pulcino DRG e coni di crescita della retina mediante l'attivazione locale della F-actina actina rottura delle proteine depolimerizzazione fattore (ADF / cofilina) nella regione del cono di crescita più vicini ad un 80-10 attrattivo. Questa accresciuta ADF / cofilina attività separa i filamenti di actina per creare nuovi F-actina finisce spinato per la polimerizzazione. Il metodo seguito viene illustrato questo meccanismo. Contenuto totale di F-actina sono visibili con la colorazione falloidina fluorescenti. F-actina finisce spinato sono visualizzati con l'incorporamento di rodamina-actina all'interno di coni di crescita che sono permeabilizzate con la procedura descritta nel seguente, che è tratto da studi precedenti di altre cellule mobili 11, 12. Quando rodamina-actina è aggiunto ad una concentrazione al di sopra della concentrazione critica per oltre monomero di actina a fini spinato, rodamina-actina assembla sulla libera finisce spinato. Se lo spunto interessante è presentato in un gradiente, come essere liberati da una micropipetta posizionata su un lato di un cono di crescita, l'incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato sarà maggiore nella parte cono di crescita verso la micropipetta 10 .
Coni di crescita sono strutture a piccole cellule e delicato. Le procedure di permeabilizzazione, rodamina-actina incorporazione, la fissazione e la visualizzazione di fluorescenza sono tutte curate e possono essere effettuate sul palcoscenico di un microscopio invertito. Questi metodi possono essere applicati allo studio di polimerizzazione locali actina nei neuroni migrazione, altre cellule del tessuto primarie o linee cellulari.
Protocollo
Per rodamina-actina l'etichettatura, i neuroni sono coltivati su coprioggetto di vetro posto nella parte inferiore di 35 piatti di plastica mm, o su vetrini incollati in "video" piatti.
1. Preparazione del coprioggetto o "Video" Piatti
- Molti tipi di neuroni sono scarsamente adesivo per substrati in vitro. Coprioggetto di vetro, che sono necessari per questa procedura, potrebbe non consentire sufficiente neurone-substrato di adesione a meno che non siano adeguatamente puliti e preparati. Una procedura dettagliata per l'acido di lavaggio e pulizia coprioggetto di vetro è descritto nel libro coltura cellule nervose, a c....
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Discussione
I metodi qui presentati permettono risoluzione temporale e spaziale dei componenti cellulari che sono coinvolti nel rimodellamento dinamica del citoscheletro di actina al margine leader di migrazione coni di crescita. L'azione di molecole attrattivo, come NGF o netrina, per stimolare rapidamente polimerizzazione filamento si rivela come un aumento locale finisce actina spinato, creato da rottura di filamenti di actina attivato ADF / cofilina 10, come indicato nelle figure 1 e 2. Il metodo permette la loca.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. James Bamberga ei membri del suo laboratorio per la collaborazione in questi studi. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD19950, EY07133 e da finanziamenti della Minnesota Medical Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coverslip 18x18 mm | Gold Seal | 3305 | |
| Piastre di Petri da 35 mm | Falcon BD | 351008 | |
| Colla per acquari | Sigillante per acquario in silicone al 100% DAP | Qualsiasi negozio di ferramenta | |
| Poli-D-lisina (pm > 300.000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Laminina murina naturale | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Phalloidina Alexa-fluor 350 | Invitrogen | A22281 | |
| Actina non muscolare rodamina | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| Mezzo di coltura F12 | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
Riferimenti
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. ....
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Ristampe e permessi
