Summary
تم وصف طريقة لتصور وتحديد F - أكتين ينتهي الشائكة في مخاريط نمو الخلايا العصبية. بعد زراعة الخلايا العصبية على coverslips الزجاج ، وpermeabilized الخلايا بمحلول سابونين المحتوية. ثم ، وهو حضانة قصيرة مع العازلة التي تحتوي على صابونين رودامين - أكتين يشتمل على تاريخ أكتين الفلورسنت الأكتين الحرة الشائكة.
Abstract
تسمى نصائح متحركة من محاور النمو مخاريط النمو. مخاريط النمو يؤدي التنقل من خلال المحاور الأنسجة النامية من خلال التفاعل مع أعرب محليا العظة التوجيه المستقبلات الجزيئية التي تربط مخروط النمو وتنظيم ديناميات وتنظيم الهيكل الخلوي 3-6 مخروط النمو. الهدف الرئيسي من هذه الإشارات الملاحية هو meshwork خيوط الأكتين الذي يملأ المحيط مخروط مخروط النمو ودفع عجلة النمو الاقتصادي الذي من خلال حركية البلمرة أكتين المستمر وإعادة تشكيل ديناميكية 7. إشارات إيجابية أو التوجيه جذابة لحث مخروط النمو التي تحول خيوط الأكتين تحفيز (F - أكتين) البلمرة في المنطقة للنمو هامش مخروط هو أقرب مصدر جاذب جديلة. هذا بلمرة أكتين محركات النمو المحلية نتوء مخروطي ، التصاق الهامش الرائدة واستطالة محواري نحو جاذب.
خيوط الأكتين البلمرة يعتمد على توافر ما يكفي من مونومر أكتين ونوى البلمرة أو ينتهي خيوط الأكتين الشائكة لإضافة مونومر. أكتين مونومر يتوفر بكثرة في العقدة الجذر الفرخ الشبكية والظهري (DRG) مخاريط النمو. وبالتالي ، البلمرة يزيد بسرعة عندما حرر F - أكتين ينتهي الشائكة تصبح متاحة للإضافة مونومر. هذا يحدث في DRG الفرخ ومخاريط الشبكية النمو عن طريق تنشيط المحلي للأكتين قطع البروتين F - أكتين depolymerizing عامل (ADF / cofilin) في منطقة مخروط النمو أقرب إلى 80-10 جاذب. هذا يزيد ADF / cofilin النشاط يقطع خيوط الأكتين لخلق فرص عمل جديدة من طراز F - أكتين ينتهي الشائكة للبلمرة. الأسلوب التالي يوضح هذه الآلية. المحتوى الكلي من طراز F - أكتين هو تصور من خلال تلطيخ مع phalloidin الفلورسنت. F - أكتين ينتهي الشائكة هي تصور عن طريق دمج أكتين - رودامين داخل مخاريط النمو التي permeabilized للإجراءات المبينة في ما يلي ، وهو مقتبس من الدراسات السابقة من الخلايا متحركة أخرى 11 ، 12. عند إضافة رودامين - الأكتين عند تركيز أعلى من تركيز حاسم لمونومر أكتين بالإضافة إلى نهايات الشائكة ، رودامين - أكتين تجمع على تاريخ الشائكة الحرة. إذا تم عرض جديلة جذابة في الانحدار ، مثل الإفراج عنه من micropipette المتمركزة على جانب واحد من مخروط النمو ، فإن إدماج رودامين - F - أكتين على أكتين ينتهي الشائكة يكون أكبر في نمو الجانب مخروط نحو 10 micropipette .
مخاريط النمو هي هياكل الخلية الصغيرة والدقيقة. كلها إجراءات ، permeabilization رودامين - أكتين التثبيت ، التأسيس والتصور مضان عمله بعناية ويمكن أن تجرى على مرحلة مجهر مقلوب. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لدراسة محلية بلمرة الأكتين في الخلايا العصبية المهاجرة ، وغيرها من خلايا الأنسجة الابتدائية أو خطوط الخلية.
Protocol
لرودامين - أكتين العلامات ، يتم تربيتها في الخلايا العصبية coverslips الزجاج وضعت في الجزء السفلي من 35 ملم الصحون البلاستيكية ، أو على أطباق coverslips صقها "الفيديو".
1. إعداد Coverslips أو "فيديو" صحون
- أنواع الخلايا العصبية كثيرة سيئة لاصقة في المختبر ركائز. قد coverslips الزجاج ، والتي هي المطلوبة لهذا الإجراء ، لا يسمح كافية عصبون - الركيزة الالتصاق ما لم يتم تنظيفها وإعدادها الوافية. ووصف الإجراء مفصلة لحمض الغسيل والتنظيف coverslips الزجاج في خلايا الأعصاب التثقيف الكتاب ، الذي حرره وGoslin بانكر. بدلا من ذلك ، هو وصف لطلاء النتروسليلوز coverslips ، الذي يربط جزيئات الركيزة بشوق ، في خطوات 1.7 و 1.8 أدناه.
- يتم شطف الزجاج coverslips (المربعات مثل 18 مم أو 24 مم الدوائر) في DH 2 O ويخبز في حرارة جافة (≥ 225 درجة مئوية) لأطول وقت ممكن (على الأقل لعدة أيام حتى ثلاثة أشهر أو أكثر) لإزالة آثار العضوية المركبات. انتقل إلى الخطوة 1.6 أو لأطباق الفيديو انتقل إلى 1.3.
- لإنشاء رقيقة الركيزة الزجاج واضحة لvideomicroscopy ارتفاع القرار ، ويتم حفر ثقوب دائرية بقطر المناسبة في قيعان من 35 أو 50 ملم أو أطباق بتري بلاستيكية زراعة الأنسجة باستخدام حفار الفلين الكهربائية (أو صك مماثل). ويتم الحفر ببطء مع الضغط الخفيف لتجنب تكسير البلاستيك. يتم كشط حواف حفر حفرة مع مقص لإنشاء سطح أملس على كلا الجانبين.
- يتم تنظيف الزجاج coverslips للاستخدام زراعة الأنسجة ، وكما هو موضح في 1.1 أو 1.2. يتم لصقها في مكان Coverslips أكثر من الثقوب ، باستخدام غير سامة الاسمنت الحوض السيليكون (لcoverslips 18x18mm ، يتم استخدام بت قطرها 12mm). يتم الشفاء من الاسمنت لمدة 24 ساعة.
- (تتم الخطوات التالية باستخدام ظروف معقمة) وتشطف وأطباق الفيديو 3 مرات مع العقيمة O 2 درهم ، وسمحت للهواء الجاف.
- والمغلفة مع جزيئات Coverslips الركيزة للثقافة العصبية. الأولى ، وهي مغلفة مع السطح ساترة (250 ميكرولتر ساترة ل18x18) حلا من 100 ميكروغرام / مل بولي - D - يسين في برنامج تلفزيوني لساعات 4-8 (أو بين عشية وضحاها) في ترطيب 38 حاضنة درجة مئوية. ثم يتم شطف Coverslips 3 مرات مع العقيمة O 2 درهم لإزالة غير منضم بولي - D - يسين وسمحت للهواء الجاف. يتم استزراع أنواع عديدة على coverslips العصبية المغلفة مع البولي - D - يسين وحده ، إذا لم يتم تضمين بروتينات مصل الدم في المتوسط الثقافة. ومع ذلك ، المزيد من النتائج ذات الصلة في ظروف فيفو يتم الحصول عليها باستخدام جزيئات الركيزة الطبيعية. حلول لهذه الجزيئات ، مثل laminin ، أو L1 فبرونيكتين CAM (1-20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) ، ويمكن تطبيقه مباشرة على بولي - D - يسين coverslips المغلفة لل4-8 ساعات أو بين عشية وضحاها ، ولكن في مختبرنا روتيني نحن معطف coverslips أعدت مع طبقة رقيقة من النيتروسليلوز قبل تطبيق جزيئات التصاق الخلية لزيادة البروتين الركيزة ملزمة.
- جعل الحل النيتروسليلوز 1 ٪ عن طريق إذابة 5 النيتروسليلوز غرام في 5 مل من خلات الأميل 100 ٪. 10 ميكرولتر تطبيق هذا الحل إلى ساترة وانتشارها برفق على السطح. الهواء الجاف 10 دقيقة.
- تطبيق 250 ميكرولتر من محلول 25 ميكروغرام / مل laminin أو 4 ميكروغرام / مل L1 CAM في برنامج تلفزيوني وتنتشر على سطح النيتروسليلوز. احتضان 4 ساعات (أو بين عشية وضحاها) في ترطيب حاضنة 38 درجة مئوية ، والركيزة نضح إضافة فورا مستنبت ، وبالتالي فإن الركيزة لا تجف.
2. التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية
- تتم إزالة الجنينية الأجنة يوم 7 من بيض الدجاج ، ووضعها في أطباق بتري 100 ملم تحتوي على مستنبت المصل مع 10 ٪ للتشريح لإزالة الأعضاء الداخلية من الصدر والبطن ، وذلك باستخدام stereomicroscope.
- ثم تشطف والأجنة مع المتوسط وانتقلت إلى 60 ملم مع طبق متوسط السائلة وتشريح أخرى لإزالة وإعداد explants من العقد الجذرية الظهرية (DRG) أو الأنسجة العصبية في الشبكية. ويمكن العثور على وصف تشريح المفصل في أساليب في بيولوجيا الخلية ، وحجم 71 ، الخلايا العصبية : أساليب وتطبيقات لبيولوجيا الخلايا ، الذي حرره ونقل بيان عسكري Bamburg. explants DRG هي 1/2-whole العقد العصبية في الشبكية وexplants هي 1 ملم أو أقل في القطر.
- بعد تنظيف explants أنسجة غريبة ، يتم نقل explants الفردية مع ملقط لcoverslips الساعات ، والتي هي بالفعل في أطباق الثقافة مع ثقافة المتوسط. تشريح تحت المجهر ، يتم الضغط برفق لازدراع مركز ساترة مع ملقط لمنع الحركة في حين نقل إلى الحاضنة. يتم تربيتها في Explants F12 المتوسطة مع B27 المضافة ، مخزنة مع 10 ملم إلى HEPES 7.4 درجة الحموضة ووضعها بين عشية وضحاها في ترطيب حاضنة 38 درجة مئوية. يمكن إضافة عوامل النمو ، حسب الحاجة ، إلى مستنبت. وغالبا ما يضاف إلى Neurotrophins DRG الثقافات القديمة من الأجنة ، وإن E7 الخلايا العصبية DRG ستمتد محاور عصبية من دون explants neurotrophins المضافة. Explants العصبية للشبكية تمديد المحاوير في هذه الوسيلة من دون ثقافةdding عوامل النمو.
- يتم تحضين الثقافات لا يقل عن 18 ساعة للسماح ثمرة محواري كافية قبل بداية الإجراء أدناه.
3. إعداد مخزن Permeabilization رودامين - أكتين
- يمكن الاحتفاظ بمخزون من حل permeabilization العازلة التي تحتوي على 138 ملي بوكل ، 10 أنابيب مم ، 3 مم EGTA ، 4mM MgCl 2 ، و 1 ٪ BSA (الرقم الهيدروجيني = 6.9) لتصل إلى 2 في الأسابيع C11 ° 4. قبل الاستخدام ، يتم إضافة العناصر التالية لتركيز النهائي : سابونين 0.025 ٪ ، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين ، و 100 نانومتر اليكسا - 350 phalloidin ثر.
- هو أيضا حل منفصل الطازجة فقط قبل استخدامه مع هذه المكونات نفسها زائد 0.45μM رودامين غير العضلات أكتين هو الحل vortexed بالتناوب وtritrated لمدة 5 دقائق لإذابة رودامين - أكتين كتل ، وvortexed ل1 دقيقة خلال الخطوة الأولي permeabilization لمنع البلمرة في الأنبوب. إذا على الرغم من هذا ، والتجمع ، خيوط في أنبوب لا يزال يمثل مشكلة ، ويمكن طرد الحل قبل الاستخدام.
4. Permeabilization الثقافات الخلايا العصبية وإدماج أكتين - F - رودامين على أكتين ينتهي شائك.
- تتم إزالة بعناية طبق الثقافة مع explants DRG أو شبكية العين من الحاضنة ويتم تنفيذ الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.
- يجب أن تتم جميع التغييرات الحلول بعناية. يجب وضع الطرف ماصة على حافة ساترة ، وينبغي إزالتها الحلول وأضاف ببطء وبكل قوة ممكنة.
- تتم إزالة مستنبت بواسطة ماصة بعناية ، ولكن بثبات ، ويضاف ما يكفي لتغطية permeabilization العازلة للخلايا 1 دقيقة (ساترة لX 18mm 18mm ، ~ 60 ميكرولتر). لا تشطف الثقافة مع أي حلول أخرى قبل إضافة permeabilization العازلة ، وغير مسموح ساترة لتجف قبل إضافة permeabilization العازلة.
- تتم إزالة بلطف العازلة permeabilization بواسطة ماصة والاستعاضة عنها العازلة التي تحتوي على 0.45 ميكرومتر permeabilization رودامين غير أكتين العضلات لمدة 4 دقائق.
- تتم إزالة بلطف رودامين - أكتين المحتوية العازلة ماصة ، ويتم إصلاح الخلايا العصبية عن طريق إضافة محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (الصف المختبر ، أدلى مع العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.3) ، غلوتارالدهيد 0.05 ٪ والسكروز 10 ٪. بعد 5 دقائق يتم تثبيت تشطف بلطف coverslips مع برنامج تلفزيوني ، والتي تقام في Slowfade على الشرائح الزجاجية 3 بوصة.
- نهجا بديلا للحلول المتغيرة لاستخدام خلية التدفق. هذا يمكن ان يكون خلية تدفق المتاحة تجاريا ، أو يمكن جعلها خلية تدفق بسيط عن طريق وضع قطعة صغيرة من البلاستيك (≤ 1 مم) والفواصل في زوايا ساترة ، ومن ثم شن ساترة متساوية الحجم على رأس ساترة. يمكن تبادلها من خلال وضع حلول ماصة في جانب واحد من الخلية التدفق وسحب الفتيل مع حلول (القطن أو Kimwipe أ) في الجانب الآخر.
- إدماج أكتين - F - رودامين على أكتين ينتهي الشائكة والفلورسنت - phalloidin توسيم أكتين - F في مخاريط النمو هو تصور مع البرنامج الموسع للتمنيع ومضان البصريات من خلال الهدف الغمر 60X النفط ، ويتم جمع الصور ، وذلك باستخدام كاميرا CCD تبريده. ويجوز للمجهر مبائر توفير التصوير محسن.
- وينبغي للحصول على أفضل تقدير حجم رودامين - أكتين التأسيس يتم جمع كل الصور في جلسة واحدة ، وذلك باستخدام نفس اكتساب وضبط التعرض لحساسية الكاميرا الرقمية لكل صورة. وينبغي إجراء تحليل لوضع العلامات من المناطق ما يعادل كل صورة ، ويمكن استخدام Metamorph ، J صورة أو الأدوات المحوسبة مماثلة لتحليل الصور.
اختلافات من هذا الإجراء
5. الاختلاف الأول : جمع صور خلية حية قبل رودامين - أكتين الوسم
- توضع الأطباق الفيديو في الصعود إلى منصة المجهر تحسنت ، ويتم جمع الصور الحية مخروط النمو. ويمكن استخدام coverslips الشبكية ، أو يمكن جعلها ختوم و / أو علامات القلم على ساترة لأكثر سهولة العثور خلايا معينة بعد وضع العلامات ، أو يمكن ان تكون ثابتة الطبق الفيديو في مكان على المسرح المجهر لمدة الإجراء.
- وتجرى Permeabilization ، إدماج أكتين - رودامين ، وتثبيت الخلية في طبق الفيديو ، سواء على المسرح أو إيقاف المجهر. بعد إصلاح ، إضافة إلى الأطباق PBS فيديو للتصوير الفوري. للحفاظ على عينة من أجل التصوير في وقت لاحق ، يضاف slowfade المتوسطة المتزايدة إلى ساترة ويوضع بلطف ساترة متساوية في الحجم على رأس (تجنب الفقاعات) ، ويتم بعد ذلك ختم حواف مع طلاء الأظافر واضحة.
6. الاختلاف الثاني : المناعية لبروتينات المشارك التسمية الإضافية
- ويمكن إجراء رودامين - أكتين التأسيس والتثبيت على الخلايا العصبية مثقف على coverslips في أطباق أو الفيديو ، كما هو موضح أعلاه (4،2-4،4).
- بعد التثبيت ، والشطف في برنامج تلفزيوني ، وتعامل الخلايا لمدة 15 دقيقة مع جليكاين M 0.1 في برنامج تلفزيوني ومن ثم استخراج بنسبة 0.1 ٪ تريتون X - 100 (TX - 100) في برنامج تلفزيوني مع مصل الماعز 2 ٪ و 1 ٪ لجيش صرب البوسنة 1 ساعة. Coverslipsيتم تحضين مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني يتضمن BSA 1 ٪ لمدة 1 ساعة. وتشطف ثم coverslips والمحتضنة في 0.1 ٪ TX - 100 في برنامج تلفزيوني مع مصل الماعز 2 ٪ و 1 ٪ لجيش صرب البوسنة 1 ساعة ، قبل تطبيق الفلورسنت الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف 1:1000 في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ لمدة 1 ساعة. بعد الشطف ، ويتم تحضين مرة أخرى بنسبة 0.1 ٪ في coverslips TX - 100 في برنامج تلفزيوني مع مصل الماعز 2 ٪ و 1 ٪ BSA لمدة 30 دقيقة ، وتشطف ، والتي تقام في مكافحة يتلاشى المتوسط. تعطل توطين بعض البروتينات التي الخطوة permeabilization الأولي (4.3). يمكن الإبقاء على هذه البروتينات للتوطين مع الأجسام المضادة ، بارافورمالدهيد 0.05 ٪ 0.05 ٪ وغلوتارالدهيد تضاف إلى المخزن المؤقت للpermeabilization 1 دقيقة (أي قبل إضافة رودامين - أكتين) دون التأثير على وسم نهاية الشائكة التي أكتين - رودامين.
- يتم جمع الصور من مخاريط النمو الثلاثي المسمى أو بواسطة المجهر مضان مبائر.
7. الاختلاف الثالث : تقييم آثار الإشارات توجيهات بشأن ينتهي F - أكتين شائك الحرة
- يضاف عامل النمو أو جديلة التوجيه للثقافة الأطباق في الحاضنة بتركيزات عدة نانوغرام / مل لمدة بضع دقائق (أو وقت العلاج المناسب) قبل إزالة الطبق من الحاضنة وبداية الإجراء permeabilization. وهذا يسمح بتقييم آثار على المدى القصير من عوامل النمو أو العظة توجيهات بشأن ينتهي F - أكتين الشائكة الحرة.
- يمكن وضعها في طبق الفيديو مع الثقافات العصبية في مرحلة المجهر تحسنت ، ويمكن إطلاق عوامل النمو او اشارة التوجيه من micropipette في الانحدار قرب مخروط النمو قبل البدء في عملية التأسيس وpermeabilization رودامين - أكتين. على سبيل المثال ، يمكن أن يتم الافراج عن NGF DRG الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية لnetrin العقدة الشبكية. ويمكن عرض ماصة للقصيرة قدر 1-2 دقائق قبل البدء في إجراء permeabilization. وهذا يسمح بتقييم الآثار المحلية لتوجيه التدرج جديلة على تشكيل ينتهي F - أكتين الشائكة الحرة في هوامش مخروط النمو الرائدة (انظر الاستشهاد المرجعي للصور 10).
- ويمكن الجمع بين هذه الاختلافات مع الأضداد بوساطة العلامات من مكونات الخلايا العصبية الأخرى ، كما هو موضح في 6.2 أعلاه.
8. الاختلاف الرابع : F - الأكتين الحرة وصفها الأخير شائك على الخلايا العصبية Transfected
- ويمكن استخدام استخدام البنى النشطة constitutively المهيمنة أو سلبية أو ضربة قاضية البروتين باستخدام رني (مع تحديد علامة الفلورسنت) لتقييم تورط بروتين في تنظيم F - أكتين ينتهي الشائكة الحرة. اعتمادا على البروتين ، والتوطين في غضون مخروط النمو ، وإذا كان لتنصهر علامة فلوري ، قد يتم فقدان البروتين في الخلايا وأعرب الفلورسنت transfected permeabilization عليها. إذا كان هذا هو الحال ، يمكن استخدام الأطباق الفيديو لتحديد خلية قبل permeabilization transfected المجهر ، ويمكن إجراء permeabilization على المسرح المجهر ، بعد وسم مواقف transfected الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون بناء GFP - أكتين transfected المشترك مع بناء GFP - المصالح. في هذه الحالة ، سيتم إدراجها في GFP - F - أكتين أكتين ، وسوف لن تكون فقدت من permeabilization ، تمكن من تحديد الخلايا transfected permeabilization بعد.
- ويمكن الجمع بين هذا الاختلاف مع إضافة إشارات التوجيه ، كما هو موضح في 7،1-7،3 أعلاه.
9. ممثل النتائج
الشكل 1. بالإضافة العالمية NGF مجموع الزيادات F - F - أكتين وأكتين ينتهي الشائكة على نمو الهامش مخروط الرائدة ، وعندما يتم تحفيز النمو مخروط DRG مع عامل نمو الاعصاب (نيسان الخليج) لمدة 5 دقائق ، ويتم تحفيز بلمرة أكتين على هامش الرائدة ، و وينظر الى الفرقة مشرق من رودامين - أكتين العلامات حول نمو هامش مخروط. الشكل 1 - أكتين يقارن رودامين التأسيس إلى DRG مخروط النمو unstimulated وNGF - حفز النمو مخروط DRG. ومضان أخضر في دمج الصور والعلامات phalloidin لأكتين - F في مخروط النمو والحمراء رودامين - أكتين التوسيم. ومراقبة جيدة لوسم نهاية الشائكة هي إضافة M 06/10 مثبط حركة الخلايا B أو أعلى أو التطوير في المنطقة العازلة في الخطوات permeabilization 4.2 و 4.3. Cytochalasins قبعة من طراز F - أكتين ينتهي شائكة وتمنع رودامين - أكتين ملزمة لينتهي الشائكة. ينبغي لهذا الحد أو القضاء عليها بشدة دمج أكتين - رودامين في الخلية. أشرطة النطاق ، 10 ميكرومتر.
الشكل 2. ويزيد الانحدار NGF محليا من طراز F - أكتين ينتهي الشائكة. micropipette والنشرات التي يتم إحضارها إلى NGF جانب واحد من مخروط النمو DRG لمدة 2 دقيقة ، تليها توسيم F - أكتين ينتهي الشائكة الحرة. الصور أدناه تظهر أن التعرض للتدرج من NGF محليا يحفز زيادة في تاريخ F - أكتين الشائكة الحرة في منطقة مخروط النمو أقرب إلى ماصة. الصورة المدمجة phalloidin يظهر باللون الأخضرورودامين - أكتين باللون الأحمر. مقياس بار ، و 10 ميكرومتر.
الشكل 3. ERM بروتينات تتراكم في تنشيط نمو الهامش مخروط الرائدة. التوسيم Immunocytochemical من phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) مع نهايات F - أكتين الشائكة الحرة. أضيفت Gluteraldehyde (0.05 ٪) وبارافورمالدهيد (0.05 ٪) إلى المخزن المؤقت permeabilization الأولي لمدة دقيقة للحفاظ على توطين ERM. رودامين - أكتين ، أحمر ، بيرم ، الأخضر ؛ phalloidin ، الأزرق. مقياس بار ، و 10 ميكرومتر.
الشكل 4. تحفيز بلمرة أكتين يتطلب ERM البروتينات النشطة. DRGs فصلها والتعاون مع transfected GFP - أكتين والتحكم GFP البلازميد أو السلبية السائدة بناء Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM). استخدام GFP - أكتين يتيح تحديد الخلايا transfected permeabilization بعد. هنا ، كان NGF أضاف 5 دقائق قبل وضع العلامات من طراز F - أكتين ينتهي الشائكة. لاحظ مخروط النمو transfected مع ERM DN خفضت مستويات نهاية الشائكة في نمو الهامش مما يؤدي مخروط (لوحة المتوسطة الدنيا) ، والذي يتناقض مع مخروط النمو untransfected قريب (أقل لوحات) ، أو مع GFP التحكم (لوحة العلوي الأوسط). رودامين - أكتين ، الحمراء ؛ GFP - أكتين ، الأخضر. أشرطة النطاق ، 10 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدم هنا طرق تسمح القرار الزماني والمكاني من المكونات الخلوية التي تشارك في إعادة عرض ديناميكية الهيكل الخلوي أكتين على هامش الرائدة في مجال الهجرة مخاريط النمو. وكشف عن عمل الجزيئات الجاذبة ، مثل NGF أو netrin ، لتحفيز بلمرة خيوط الأكتين بسرعة وزيادة المحلية في تاريخ أكتين الشائكة ، التي أنشأتها قطع خيوط الأكتين عن طريق تنشيط ADF / cofilin 10 ، كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. الأسلوب يسمح توطين البروتينات الأخرى المشاركة في الوساطة الردود كيميائي التوجه مخروط النمو ، مثل radixin ، وهو بروتين ERM ، المصورة في أرقام 3 و 4. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطرق لتحليل تنظيم أكتين المستندة إلى الخلايا العصبية الحركية في الهجرة ، أو الخلايا الدبقية أنواع الخلايا الأخرى.
طبيعة حساسة من مخاريط النمو أو غيرها من الهياكل صغيرة متحركة وجود قيود كبيرة في استخدام هذا الأسلوب. هوامش مخروط النمو الرائدة متحركة أو المناطق المماثلة من الخلايا تحتوي على العناصر الهيكلية قليلة أخرى من خيوط الأكتين وغشاء البلازما ، لذا يجب توخي الحذر في كل خطوة. قد تعطلت المجاميع explants الخلية أو عن تغيرات في التوتر السطحي ، كما يتم تبادل الحلول. كما ورد في البروتوكول ، فمن الأفضل لوضع ماصات على حافة coverslips لتغيير الحلول ، واستخدام خلية تدفق سيقضي على المشاكل من التوتر السطحي.
أسلوب بديل لتصور تاريخ أكتين الشائكة في مناطق متحركة من الخلايا يتضمن الخلية ترنسفكأيشن للتعبير عن النظير من البروتينات الفلورية نهاية الملزمة الشائكة ، مثل إينا / VASP أو عاشرا الميوسين ومع ذلك ، قد يتم تغيير الديناميات في هوامش أكتين مخروط النمو من خلال التعبير غير المنظم من هذه البروتينات أكتين التنظيمية.
لا أرجل كاذبة خيطية والمسمى بقوة بهذه الطريقة وضع العلامات رودامين - أكتين lamellipodia كما هي. قد يكون تعطل أرجل كاذبة خيطية ، على الرغم من أنها وصفت واستقرت بها phalloidin فلوري ، الواردة في permeabilization العازلة. قد يكون هذا الاختلاف في مقابل إدراج lamellipodial filopodial أكتين - رودامين تعكس وجود قيود كمية في التصور للتدرج رودامين - أكتين ، أو قد يكون هناك اختلاف في وجود نهاية الشائكة متوجا البروتينات في هذه الهياكل متحركة. هذا يثير قيود إضافية على أن تنتهي من وضع العلامات الشائكة الحرة مع هذا الأسلوب لا يكشف ما إذا كانت المنشأة حديثا في تاريخ المسمى الشائكة ، مثل ADF / cofilin قطع F - أكتين ، أو ما إذا لم يتم قطع F - أكتين لكن ينتهي الشائكة يتم الافراج عن طريق إزالة نهاية الشائكة متوجا البروتينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب نشكر الدكتور جيمس Bamburg وأعضاء مختبره للتعاون في هذه الدراسات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD19950 ، EY07133 والمنح المقدمة من المؤسسة الطبية ولاية مينيسوتا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
