Summary
Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.
Abstract
Las puntas móviles de los axones en crecimiento se llaman los conos de crecimiento. Los conos de crecimiento llevan navegando a través de los axones tejidos en desarrollo mediante la interacción con las señales a nivel local expresó su orientación molecular que se unen a los receptores de cono de crecimiento y regular la dinámica y la organización del citoesqueleto de crecimiento de 6.3 cono. El objetivo principal de estas señales de navegación es la malla de filamentos de actina que llena la periferia del cono de crecimiento y que el crecimiento de las unidades de la motilidad del cono a través de polimerización de la actina y la remodelación continua dinámica 7. Señales de orientación positiva o atractivo inducir cono de crecimiento de inflexión mediante la estimulación de filamentos de actina (F-actina) de polimerización en la región de la periferia del cono de crecimiento que está más cerca de la fuente de la señal atrayente. Esta polimerización de la actina unidades cono de crecimiento local saliente, la adhesión del margen de líderes y la elongación axonal hacia el atrayente.
Polimerización de la actina del filamento depende de la disponibilidad de monómero de actina suficiente y en los núcleos de polimerización de filamentos de actina o los extremos de púas para la adición de monómero. Actina monómero está disponible en abundancia en el ganglio de la raíz de pollo y la retina dorsal (GRD) los conos de crecimiento. En consecuencia, la polimerización se incrementa rápidamente cuando es libre F-actina fines de púas que se disponga para la adición de monómeros. Esto ocurre en el pollo y los conos de la retina DRG crecimiento a través de la activación local de la actina cortar la F-actina proteína de factor de despolimerización (ADF / cofilina) en la región del cono de crecimiento cercano a un 80-10 atrayente. Este incremento de la ADF / cofilina actividad rompe los filamentos de actina para crear nuevos F-actina fines de púas para la polimerización. El método siguiente se muestra este mecanismo. Contenido total de F-actina se visualizaron por tinción con phalloidin fluorescente. F-actina fines de púas son visualizados por la incorporación de la rodamina-actina dentro de los conos de crecimiento que se permeabilized con el procedimiento descrito en el siguiente, que es una adaptación de los estudios previos de otras células móviles 11, 12. Cuando rodamina-actina se añade a una concentración por encima de la concentración crítica para la adición de monómeros de actina a los fines de púas, rodamina-actina reúne a los extremos libres de púas. Si la señal atractiva se presenta en una pendiente, como la de ser liberado de una micropipeta colocada a un lado de un cono de crecimiento, la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas será mayor en el lado del cono de crecimiento hacia la micropipeta 10 .
Los conos de crecimiento son las estructuras celulares pequeños y delicados. Los procedimientos de permeabilización, rodamina-actina incorporación, la fijación y la visualización de fluorescencia son cuidadosamente hecho y puede llevarse a cabo en el escenario de un microscopio invertido. Estos métodos pueden ser aplicados al estudio de polimerización de la actina en las neuronas migratorias locales, otras células de los tejidos primarios o líneas celulares.
Protocol
Para el etiquetado de rodamina-actina, las neuronas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio colocados en la parte inferior de 35 mm platos de plástico, o en cubreobjetos pegado en "video" platos.
1. Preparación de platos Cubreobjetos o "Video"
- Muchos tipos neuronales son poco adhesivo para sustratos in vitro. Cubreobjetos de vidrio, que son necesarios para este procedimiento, no puede permitir que suficientes neuronas sustrato de adhesión, a menos que hayan sido limpiados adecuadamente y preparado. Un procedimiento detallado para el ácido de lavado y limpieza cubreobjetos de vidrio se describe en el libro El cultivo de las células nerviosas, editado por Banker y Goslin. Por otra parte, una capa de nitrocelulosa para el cubreobjetos, que se une con avidez las moléculas de sustrato, se describe en los pasos 1.7 y 1.8 a continuación.
- Cubreobjetos de vidrio (por ejemplo, 18 plazas mm o 24 mm círculos) se lavan en dH 2 O y cocido en calor seco (≥ 225 ° C) el mayor tiempo posible (mínimo de varios días hasta tres meses o más) para eliminar los restos de materia orgánica compuestos. Vaya al paso 1.6 o para platos de vídeo proceder a 1,3.
- Para crear un substrato fino de vidrio transparente para videomicroscopía alta resolución, agujeros circulares de diámetro apropiado son perforados en el fondo de los 35 o 50 mm Petri de plástico o los platos de cultivo de tejidos utilizando un taladro eléctrico de corcho (o un instrumento similar). La perforación se realiza lentamente con una ligera presión para evitar que se rompa el plástico. Los bordes de la perforación se raspan con una tijera para crear una superficie lisa en ambos lados.
- Cubreobjetos de vidrio se limpian para el uso de cultivo de tejidos, como se describe en 1.1 o 1.2. Cubreobjetos se pegan en el lugar sobre los agujeros, no se usen los tóxicos de cemento acuario de silicona (para cubreobjetos 18x18mm, un poco de 12mm de diámetro se utiliza). El cemento se cura durante 24 horas.
- (Los siguientes pasos se realizan utilizando las condiciones de esterilidad) Los platos de vídeo se lavan 3 veces con agua estéril dH 2 O y se deja secar al aire.
- Cubreobjetos están recubiertas con moléculas de sustrato para el cultivo neuronal. En primer lugar, la superficie está recubierta con cubreobjetos (250 l de 18x18 cubreobjetos) una solución de 100 mg / ml de poli-D-lisina en PBS durante 4-8 horas (o toda la noche) en una incubadora humidificada 38 ° C. Cubreobjetos se enjuagan 3 veces con agua estéril dH 2 O para eliminar consolidados poli-D-lisina y se deja secar al aire. Muchos tipos neuronales cultivadas en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina a solas, si las proteínas séricas están incluidos en el medio de cultivo. Sin embargo, los resultados más relevantes para las condiciones in vivo se obtienen mediante el uso de moléculas de sustrato natural. Las soluciones de estas moléculas, como la laminina, fibronectina o L1 CAM (1-20 mg / ml en PBS), se pueden aplicar directamente a la poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos de 4-8 horas o toda la noche, pero en nuestro laboratorio de rutina cubrir el cubreobjetos preparado con una fina película de nitrocelulosa antes de aplicar las moléculas de adhesión celular para aumentar la proteína de unión al sustrato.
- Prepare una solución de nitrocelulosa 1% en la disolución de 5 g de nitrocelulosa en 5 ml de 100% acetato de amilo. Aplique 10 l de esta solución para el cubreobjetos y suavemente repartidas en la superficie. Deje secar al aire 10 minutos.
- Aplicar 250 l de una solución de 25 mg / ml laminina o 4 mg / mL L1 CAM en PBS y se extendió sobre la superficie de nitrocelulosa. Incubar 4 horas (o toda la noche) en un incubador humidificado 38 ° C, el sustrato aspirado e inmediatamente después, medio de cultivo, por lo que el sustrato no se seque.
2. Preparación de los cultivos neuronales
- Embrionarias día 7 embriones de pollo se eliminan los huevos y los colocó en 100 mm placas de Petri que contienen medio de cultivo con suero al 10% para la disección para extraer los órganos internos del tórax y el abdomen, utilizando un microscopio estereoscópico.
- Los embriones se enjuagan con el medio y se mudó a un plato de 60 mm con medio líquido y más disección para extraer y preparar los explantes de ganglios de la raíz dorsal (GRD) o los tejidos neurales de retina. Una descripción de la disección detallada se puede encontrar en Métodos en Biología Celular, volumen 71, Neuronas: Métodos y Aplicaciones de la Biología Celular, editado por Hollenbeck y Bamburg. Explantes de DRG son los ganglios y nervios 1/2-whole explantes de retina son de 1 mm de diámetro o menos.
- Después de limpiar los explantes de tejidos extraños, los explantes individuales se mueven con unas pinzas de relojero los cubreobjetos, que ya están en placas de cultivo con medio de cultivo. Bajo un microscopio de disección, el explante se presiona suavemente hacia el centro del cubreobjetos con unas pinzas para evitar el movimiento durante el transporte a la incubadora. Los explantes se cultivaron en medio F12 B27 con aditivos, tamponado con HEPES 10 mM a pH 7,4 y se colocan durante la noche en una incubadora humidificada 38 ° C. Los factores de crecimiento se pueden añadir, según sea necesario, al medio de cultivo. Las neurotrofinas son a menudo añadido a DRG culturas de los antiguos embriones, aunque E7 neuronas DRG se extenderá axones de explantes sin neurotrofinas añadió. Explantes de retina neural se extienden los axones en el medio de cultivo sindding factores de crecimiento.
- Los cultivos se incuban durante al menos 18 horas para permitir crecimiento axonal suficiente antes de iniciar el procedimiento siguiente.
3. Preparación de la permeabilización de amortiguación Rodamina-actina
- Una solución de reserva de permeabilización de amortiguación que contiene 138 mM KCl, 10 mM TUBOS, 3 mM EGTA, 4 mm de MgCl 2, y 1% de BSA (pH = 6,9) se puede mantener hasta 2 semanas a 4 ° C11. Justo antes de su uso, los componentes se añaden a una concentración final de: 0,025% de saponina, 0,1 mM de ATP, y 100 nM Alexa-flúor 350 phalloidin.
- Una solución por separado es también recién preparada justo antes de su uso con estos mismos componentes más rodamina 0.45μM no actina de músculo La solución se agita y tritrated alternativamente durante 5 minutos para disolver la actina rodamina-grupos, y se agita durante 1 minuto durante el paso de permeabilización inicial para prevenir la polimerización en el tubo. Si a pesar de ello, el montaje del filamento en el tubo sigue siendo un problema, la solución puede ser centrifugadas antes de su uso.
4. Permeabilización de cultivos neuronales y la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina Finaliza púas
- Una placa de cultivo con explantes de DRG o la retina ha sido cuidadosamente retirados de la incubadora y los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente.
- Todos los cambios de las soluciones debe hacerse con cuidado. La punta de la pipeta se debe colocar en el borde del cubreobjetos, y las soluciones deben ser retirados y se añade lentamente y con una fuerza mínima.
- El medio de cultivo se extrae con una pipeta con cuidado, pero sin pausa, y la permeabilización de amortiguación suficiente para cubrir las células se añade durante 1 minuto (para 18mm x 18mm cubreobjetos, ~ 60 l). La cultura no se enjuaga con cualquier otra solución antes de añadir la permeabilización de amortiguación y el cubre no se deja secar antes de añadir la permeabilización de amortiguación.
- La permeabilización de amortiguación se quita suavemente con una pipeta y se sustituye con la permeabilización de amortiguación que contiene 0,45 M rodamina no actina de músculo durante 4 min.
- La rodamina-actina que contiene el tampón se quita suavemente con una pipeta, y las neuronas se fija mediante la adición de una solución de paraformaldehído al 4% (calidad laboratorio, realizados con tampón fosfato, pH 7,3), glutaraldehído al 0,05% y el 10% de sacarosa. Después de la fijación de 5 minutos el cubreobjetos con cuidado son lavadas con PBS, y se montaron en Slowfade en portaobjetos de vidrio de 3 pulgadas.
- Un enfoque alternativo a las soluciones de cambio es el uso de una celda de flujo. Esto puede ser una celda de flujo disponible en el mercado, o una celda de flujo simple se puede hacer mediante la colocación de pequeñas piezas de plástico (≤ 1 mm de espesor) como separadores en las esquinas del cubreobjetos, y luego montar un cubreobjetos de igual tamaño en la parte superior de la cubreobjetos. Las soluciones pueden ser cambiados mediante la colocación de la pipeta a un lado de la celda de flujo y la retirada de las soluciones con una mecha (de algodón o Kimwipe a) en el otro lado.
- La incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas y fluorescentes phalloidin etiquetado de F-actina en los conos de crecimiento se visualiza con epi-fluorescencia óptica a través de un objetivo de inmersión 60X, y las imágenes se recogen, con una cámara CCD enfriado. Un microscopio confocal puede proporcionar mejores imágenes.
- Para un mejor cuantificación de la incorporación de rodamina-actina todas las imágenes se deben recoger en una sola sesión, con la misma ganancia y ajustes de la exposición de la sensibilidad de la cámara digital para cada imagen. Análisis de la etiqueta deberán hacerse en regiones equivalentes de cada imagen; Metamorph, J de la imagen o similares herramientas informáticas para el análisis de imagen se puede utilizar.
Variaciones de este procedimiento
5. Una variación: Recoge imágenes de células vivas Antes de etiquetado Rodamina-actina
- Platos de vídeo se colocan en una platina del microscopio se calentó, y las imágenes en directo cono de crecimiento se recogen. Cubreobjetos cuadrícula se pueden utilizar, o grabados y / o marcas de lápiz sobre el cubreobjetos se puede hacer para encontrar más fácilmente después de células específicas de etiquetado, o el plato de vídeo se puede fijar en su lugar en la platina del microscopio para la duración del procedimiento.
- Permeabilización, la incorporación de rodamina-actina, y la fijación de células se llevan a cabo en el plato de vídeo, ya sea dentro o fuera de la platina del microscopio. Tras la fijación, PBS, se añade a los platos de vídeo para obtener imágenes de inmediato. Para conservar la muestra para obtener imágenes de tarde, media slowfade montaje se añade a la cubreobjetos y un cubreobjetos de igual tamaño, se coloca suavemente en la parte superior (evitando las burbujas), y los bordes son sellados con esmalte transparente.
6. Dos variaciones: inmunoquímica de proteínas etiqueta adicional Co-
- Rodamina-actina incorporación y fijación puede llevarse a cabo en las neuronas cultivadas en cubreobjetos o en platos de vídeo, como se describió anteriormente (4.2 a 4.4).
- Después de la fijación y lavado en PBS, las células son tratadas 15 min con 0,1 M de glicina en PBS y se extrae con 0,1% Triton X-100 (TX-100) en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h. Cubreobjetosse incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en PBS con 1% BSA durante 1 h. Los cubreobjetos se enjuagan y se incubaron en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h, antes de aplicar fluorescente secundaria de anticuerpos en la dilución 1:1000 en PBS con BSA al 1% durante 1 h. Después de enjuagar, los cubreobjetos se incuba de nuevo en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra al 2% y 1% BSA durante 30 minutos, enjuagar y montar en anti-fading medio. La localización de algunas proteínas se ve interrumpida por el paso de permeabilización inicial (4,3). Para conservar estas proteínas con anticuerpos para la localización, el 0,05% de paraformaldehído y glutaraldehído al 0,05% se puede agregar a la permeabilización de amortiguación durante 1 minuto (es decir, antes de añadir la rodamina-actina), sin afectar el etiquetado final de púas por rodamina-actina.
- Imágenes de los conos de crecimiento de triple etiquetado se recogen mediante microscopía de fluorescencia confocal o.
7. Variación tres: Evaluación de los Efectos de la Cues de orientación sobre la F-actina Finaliza púas gratis
- Un factor de crecimiento o cue orientación se añade a los platos de la cultura en la incubadora, en concentraciones de varios ng / mL durante unos minutos (o un tiempo de tratamiento apropiado) antes de retirar el plato de la incubadora y el inicio del procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos a corto plazo de los factores de crecimiento o las señales de orientación sobre la F-actina fines de púas libre.
- Un plato de vídeo con cultivos de neuronas puede ser colocado en una platina del microscopio se calentó, y factores de crecimiento o las señales de orientación puede ser liberado de una micropipeta en un gradiente de cerca de un cono de crecimiento antes de comenzar la permeabilización y la incorporación de rodamina-actina. Por ejemplo, el NGF puede ser liberado por las neuronas DRG o netrina de las células ganglionares de la retina neural. La pipeta se pueden introducir para tan corta como 1-2 minutos antes de comenzar el procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos locales de un gradiente de señal de orientación sobre la formación de F-actina extremos libres de púas en los márgenes del cono mayor crecimiento (ver cita de referencia para 10 imágenes).
- Estas variaciones se pueden combinar con mediado por anticuerpos etiquetado de los otros componentes neuronales, como se describe en el apartado 6.2 anterior.
8. Cuatro variación: F-actina Etiquetado extremo libre de púas en las neuronas transfectadas
- El uso de las construcciones constitutivamente activa o dominante negativo-o una caída de proteínas utilizando RNAi (con un marcador fluorescente de identificación) se puede utilizar para evaluar la participación de una proteína en la regulación de la actina F-termina de púas libre. En función de la proteína, su localización dentro del cono de crecimiento, y si se fusiona con un marcador fluorescente, la proteína fluorescente expresado en las células transfectadas pueden perderse en la permeabilización. Si este es el caso, los platos de vídeo se puede utilizar para identificar una célula transfectada microscopio antes de permeabilización, y la permeabilización se puede realizar en la platina del microscopio, después de marcar las posiciones de las células transfectadas. Por otra parte, una construcción GFP-actina se co-transfectadas con GFP-constructo de interés. En este caso, GFP-actina se incorporarán en la F-actina, y no se pierde por la permeabilización que permita la identificación de las células transfectadas después de permeabilización.
- Esta variación se puede combinar con la adición de las señales de orientación, tal como se describe en el 7,1-7,3 por encima.
9. Resultados representante
Figura 1. Además global de NGF aumenta total de F-actina y la F-actina fines de púas en el borde del cono de crecimiento líder. Cuando un cono de crecimiento DRG se estimula con factor de crecimiento nervioso (NGF) durante 5 minutos, se estimula la polimerización de la actina en el margen principal, y una banda brillante de etiquetado rodamina-actina se ve en la periferia del cono de crecimiento. La Figura 1 compara rodamina-actina incorporación en un cono de DRG crecimiento estimulada y estimulada por un NGF DRG cono de crecimiento. La fluorescencia de color verde en las imágenes fusionadas es etiquetado phalloidin de F-actina en el cono de crecimiento y el rojo rodamina-actina de etiquetado. Un buen control para el etiquetado final de púas es añadir 10-6 M o superior citocalasina B o D en la permeabilización de amortiguación en los pasos 4.2 y 4.3. Citocalasinas tapa F-actina fines de púas e inhibir la rodamina-actina a los fines de púas. Esta grave deben reducir o eliminar la incorporación de la rodamina-actina en la célula. Las barras de escala, 10 micras.
Figura 2. Un gradiente de NGF aumenta localmente F-actina fines de púas. Una micropipeta que libera NGF se pone a un lado de un cono de crecimiento DRG durante 2 minutos, seguido por el etiquetado de los F-actina extremos libres de púas. Las siguientes imágenes muestran que la exposición a un gradiente de NGF a nivel local estimula un aumento en la F-actina extremos libres de púas en la región del cono de crecimiento más cerca de la pipeta. La imagen combinada muestra phalloidin en verdey rodamina-actina en rojo. Barra de escala, 10 micras.
Figura 3. Las proteínas activadas MTC se acumulan en el margen de cono de crecimiento importantes. Etiquetado inmunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM), con F-actina fines de púas libre. Glutaraldehído (0,05%) y paraformaldehído (0,05%) fueron añadidos a la permeabilización de amortiguación inicial de un minuto para preservar la localización del MTC. Rodamina-actina, de color rojo, PERM, verde, phalloidin, azul. Barra de escala, 10 micras.
Figura 4. La estimulación de la polimerización de la actina requiere proteínas activas del MTC. GRD disociadas fueron co-transfectadas con GFP-actina y un control de plásmido GFP o una construcción dominante negativa Ezrin / radixina / Moesin (DN ERM). El uso de GFP-actina permite la identificación de las células transfectadas después de permeabilización. Aquí, el NGF se añadió 5 minutos antes de la etiqueta de la F-actina fines de púas. Nota del cono de crecimiento transfectadas con DN MTC ha reducido los niveles de púas en el margen extremo del cono de crecimiento líder (abajo centro), que contrasta con un cono de crecimiento cercanas untransfected (paneles inferiores), o con el control GFP (panel central superior). Rodamina-actina, de color rojo, GFP-actina, de color verde. Las barras de escala, 10 micras.
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Discussion
Los métodos presentados aquí permiten una resolución temporal y espacial de los componentes celulares que participan en la remodelación dinámica del citoesqueleto de actina en el borde principal de la migración de los conos de crecimiento. La acción de las moléculas de atrayente, como NGF o netrina, para estimular la rápida polimerización de la actina del filamento se revela como un aumento local en los extremos de actina de púas, creado por la ruptura de filamentos de actina por la activación de ADF / cofilina 10, como se muestra en las figuras 1 y 2. El método permite la localización de otras proteínas involucradas en la mediación de las respuestas quimiotrópica cono de crecimiento, tales como radixina, una proteína del MTC, representado en las figuras 3 y 4. Estos métodos también pueden aplicarse al análisis de la regulación de la actina basada en la movilidad en las neuronas de la migración, las células gliales o de otros tipos de células.
La naturaleza delicada de los conos de crecimiento u otras estructuras móviles pequeñas es una limitación importante en el uso de este método. Márgenes de crecimiento del cono principal o similar regiones móviles de las células contienen algunos elementos estructurales que no sean los filamentos de actina y la membrana plasmática, por lo que se debe tener cuidado en cada paso. Agregados de células o explantes pueden verse afectados por los cambios en la tensión superficial, como las soluciones que se intercambian. Como se menciona en el protocolo, lo mejor es colocar las pipetas en el borde del cubreobjetos para el cambio de las soluciones, y el uso de una celda de flujo se eliminan los problemas de tensiones superficiales.
Un método alternativo para visualizar los extremos de actina de púas en las regiones móviles de las células implica la transfección de células para expresar análogos fluorescentes de púas unión final de las proteínas, como Ena / VASP o X. miosina Sin embargo, la dinámica de actina en los márgenes del cono de crecimiento puede ser cambiado por la expresión no regulada de estas proteínas actina reglamentarios.
Filopodios no están tan fuertemente marcado por este método de etiquetado rodamina-actina como se lamellipodia. Los filopodios puede ser interrumpido, aunque se etiquetan y se estabiliza por la phalloidin fluorescente que figuran en la permeabilización de amortiguación. Esta diferencia en la incorporación lamellipodial vs filopodial de rodamina-actina podría reflejar una limitación cuantitativa en la visualización de los incorporados rodamina-actina, o puede haber una diferencia en la presencia de final púas limitación de las proteínas en estas estructuras móviles. Esto plantea una limitación adicional de que el etiquetado de los extremos libres de púas con este método no revela si los extremos de la etiqueta de púas son de nueva creación, como por ADF / cofilina ruptura de la F-actina, o si la F-actina no se corta, pero termina de púas son liberados por la eliminación del tope final púas proteínas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. James Bamburg y miembros de su laboratorio para la colaboración en estos estudios. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH HD19950, EY07133 y por becas de la Fundación Médica de Minnesota.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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