Summary
En ny metod som gör att högupplösta analysen av samspelet cancercell med exogen hyaluronsyra (HA) beskrivs. Mönstrade ytor tillverkade genom att kombinera carbodiimide kemi och microcontact utskrift.
Abstract
Cancer invasionen och progression innebär rörliga cell fenotyp, som är under komplex reglering av tillväxt faktorer / cytokiner och extracellulär matrix (ECM) komponenter inom tumören mikromiljö. Hyaluronsyra (HA) är en stromaceller ECM komponent som är känt för att underlätta tumörtillväxt genom att öka invasion, tillväxt och angiogenes 1. Interaktion av HA med cellytan receptor CD44 inducerar signalerar händelser som främjar tumörceller tillväxt, överlevnad och migration, vilket ökar metastasering 2-3. HA är en anjoniska, nonsulfated glykosaminoglykan som består av upprepade enheter av D-glukuronsyra och DN-acetylglykosamin. På grund av närvaron av karboxylgrupp och hydroxylgrupper på repeterande disackarid enheter, infödda HA är till stor del hydrofil och mottaglig för kemiska modifieringar som introducerar sulfatgrupper för photoreative immobilisering 4-5. Tidigare studier med de immobilizations av HA på ytor utnyttja bioresistant beteende HA och dess sulfaterat derivat för att kontrollera cellens vidhäftning på ytor 6-7. I dessa studier celladhesion företrädesvis sker på icke-HA-mönstrade regioner.
Att analysera cellulär interaktion med exogena HA, har vi utvecklat mönstrade functionalized ytor som möjliggör en kontrollerbar studie och högupplösta visualisering av interaktioner cancercell med HA. Vi utnyttjade microcontact utskrift (UCP) för att definiera diskret mönstrad regioner HA på glasytor. En "tjudra" inställning som gäller carbodiimide länka kemi för att immobilisera HA användes 8. Glasytor var microcontact ut med en aminosilane och reagerade med en HA lösning optimerad förhållandet mellan EDC och NHS att HA immobilisering i mönstrat matriser. Införliva carbodiimide kemi med MCP aktiverat immobilisering av HA till definierade regioner, skapar ytor som lämpar sig för in vitro-applikationer. Både koloncancer celler och bröstcancer cancerceller interagerade implicit med HA micropatterned ytor. Cancer celladhesion inträffade inom 24 timmar med spridning av 48 timmar. Använda HA micropatterned ytor visade vi att cancer cell adhesion sker genom HA-receptorn CD44. Dessutom var HA mönstrade ytor kompatibel med svepelektronmikroskop (SEM) och tillät högupplösande avbildning av lim cancercell utbuktningar och spridning på HA mönster att analysera motilitet cancer cell på exogena HA.
Protocol
1. Standard Fotolitografi för Micropatterned Stamp Fabrication
- Skölj en ny kiselskiva med etanol och torka med luftström. Använd pincett för hantering av wafer och förhindra ytdefekter under hela processen.
- Överföring wafer att snurra bestrykare och täck rånet yta med SU-2025 negativ fotoresist. Täck minst 80% av rån med fotoresist. Spin päls för 10 sekunder vid 600rpm, följt av 30 sekunder vid 3000rpm. På grund av ljuskänslighet av fotoresist, stänga rummet lampor från denna punkt framåt.
- Överför fotoresist belagda kiselskiva att värmeplatta för "soft-baka" vid 95 ° C i 3 minuter. Ta bort från värmeplattan och låt 1 minut svalna.
- Placera en prefabricerade mask med det önskade mönstret på toppen av fotoresist täckta kiselskiva och utsättas för ultraviolett (UV) strålning (350-450 nm) under 20 sekunder.
- Överföring kiselskiva att värmeplatta för "hard-baka" vid 110 ° C i 6 minuter.
- Slå på lamporna och ta bort rånet från värmeplatta. Distinkta mönster skall vara synliga på denna punkt.
- Försiktigt skölja kiselskiva med SU-8 fotoresist utvecklare. Efter 3 sköljningar med utvecklare lösning, skölj med etanol. Om någon vit rest närvarande, upprepa skölj med fotoresist utvecklare lösning, eller helt enkelt dränka skivan i utvecklare lösning i 2 minuter och fortsätt igen med etanol skölj. Tvätta med vatten och lufttorka.
- Blanda Polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer lösning och härdare i ett 10:01 vikt. Centrifugera vid 900rpm i 5 minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Placera mönstrade oblat i petriskål och häll PDMS på kiselskiva. Om det finns bubblor, plats i desicator och vakuum för ett par minuter tills bubblorna försvinner.
- Cure över natten i rumstemperatur (RT) för att bilda en kompletterande elastomeriska stämpel. Om PDMS inte är helt botad efter 12 timmar, placera i ugn vid 60 ° C i 30 minuter.
- Ta försiktigt bort PDMS från kiselskiva. Använd en rakkniv kant för att skära stämpel till önskad storlek. Sonikera i etanol i 15 minuter. Rån kan användas flera gånger för att skapa nya elastiskt frimärken.
2. HA Micropatterning
- Plasma rent glas diabilder i 5 minuter. Lägg alla bilder i kammaren och vakuum i 5 minuter. Låt sedan lågt flöde av syre att komma in kammare. Slå plasma renare på i 5 minuter. Ta bort från plasma renare och placera i en petriskål med pincett.
- Under plasma rengöring, Sonikera PDMS frimärken i etanol i 15 minuter.
- Förbered en ny 3% v / v lösning av 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) i 95% v / v etanol i ett 15 ml centrifugrör. Tillåt att reagera i 5 minuter vid RT för att bilda en silanol.
- Placera PDMS stämpel mönster-up på spin bestrykare chuck och täck mönstrad yta med APTMS lösning. Spincoat vid 3500rpm i 30 sekunder. Rör inte stämpeln yta, enbart sidorna av PDMS stämpel.
- Överför APTMS lösning på plasma rengjorda glasytor: set stämpel nedåt på ena änden av mönstrade sidan och försiktigt glida trycka PDMS så det är helt i kontakt med glaset i 1 minut.
- Ta bort PDMS stämpel försiktigt och låt mönstrade glasskiva att inkubera i RT i 30 minuter. Skölj mönstrade ytor med etanol och lufttorka. Sonikera PDMS stämpel i 15 minuter för att avlägsna överskott APTMS.
- Värme ytor i ugn eller på värmeplatta i 1 timme vid 115 ° C. Skölj med etanol och torr med luft.
- Bered en färsk polyetylenglykol (PEG)-silan lösning av 20% v / v 2 - [metoxi (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane i toluen. Detta kommer att fungera som en icke-självhäftande region som omger mönster.
- Överför mönstrade glasskiva till ett glas petriskål och inkubera i PEG-silan lösning för 45 minuter vid 75 ° C på en värmeplatta. Skölj med toluen, vatten och torka med luft.
- Sterilisera i 1 timme med UV bakteriedödande bestrålning i en biologisk säkerhet skåp. Fortsätt i biologiska säkerhetsskåp från denna punkt framåt för att bibehålla sterilitet.
- Bereda vattenhaltiga steril HA-lösning.
10 mM av 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
5mm av N-hydroxysuccinimide
50 mikrogram / ml fluorescein-märkta HA - Applicera HA lösning på mönstrat glas substrat under sterila förhållanden och skyddas mot ljus. Mönstrad substrat bör vara ostörd i 16-24 timmar.
- Sug bort HA-lösning, tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och täck ytan med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 timme. Ytan är nu klar för cellodling.
3. Cell Kultur på HA Micropatterned ytor
- Expandera MDA-MB-231 mänskliga bröstcancer celler och LS174T kolorektal cancer celler, enligt tillverkarens anvisningar.
- Seed enda cell indragningar av cancerceller med täthet mellan 0,4 och 1x10
- Cellodling ytor kan upprätthållas upp till 5 dagar i standard inkubator förhållanden. Ändra media varannan dag. Cellmorfologin och tillväxt kan observeras med hjälp av inverterat ljusmikroskop. Extra cellulära analyser kan användas för att analysera svaren på HA ytan.
4. Representativa resultat:
Den carbodiimide kemi används för att kovalent immobilisera ha till APTMS mönstrat glas bilderna visas i Figur 1A. EDC är en noll-längd crosslinking agent som reagerar med HA karboxylgrupper att bilda amin-reaktiva intermediärer. Eftersom detta mellanliggande är känslig för hydrolys, är NHS tillsättas för att öka carbodiimide reaktion effektivitet. Som HA lösning interagerar med APTMS micropatterns, en stabil amid band former mellan HA mellanliggande och primära amin av ATPMS. Ett exempel på HA-mönstrad yta visualiseras med ett fluorescerande mikroskop och en ImageJ fluorescensintensiteten analys visa mönstrade immobilisering av HA visas (Figur 1B-C).
HA micropatterned ytor gör det möjligt att studera interaktioner cancercell med expgenous HA. Både MDA-MB-231 människors bröst och LS174t mänskliga tjocktarmscancer cellinjer företrädesvis hålla sig till HA micropatterned regioner (figur 2). Högupplösta avbildning med svepelektronmikroskop kan användas för att analysera samspelet mellan odlade celler med HA immobiliserade ytor (Figur 3).
Figur 1 HA micropatterned ytor (A) Schematisk beskriver utvecklingen av HA funktionella ytor, (B) fluorescens bild av fluorescein (grön)-märkta HA micropatterned yta. (C) 3D pixel distribution karta med ImageJ programvara som visar diskreta HA mönster. Skala bar = 100μm. Modifierad från 9 med tillstånd från Elsevier.
Figur 2. Cancercell vidhäftning på HA micropatterned ytor. Båda kolon (A) och bröst (B) cancer företrädesvis levt på HA fläckar med 24 timmars kultur. Modifierad från 9 med tillstånd från Elsevier.
Figur 3. Cancercell interaktion med HA. (A) Svepelektronmikroskopi bilder av celler tjocktarmscancer (A) odlade på HA ytor visas vid låg förstoring (vänster) och hög förstoring (höger, i rutor på vänster) och av bröstcancer celler (B) odlade på HA ytor visas låg förstoring (vänster) och hög förstoring (höger; av rutor till vänster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HA micropatterning metod som presenteras tillåter att studera cellens interaktion med exogena HA. HA är kända för att spela en nyckelroll i cancer progression 1 men det har varit begränsade studier som undersöker samspelet mellan cancerceller på tvådimensionell HA mönstrade ytor. En kontrollerbar studie om exogena HA micropatterns ger högupplösta visualisering av cancer cell adhesion, tillväxt och migration och kan klarlägga ytterligare grunderna i cancer.
Genom att kombinera carbodiimide kemi och microcontact utskrift har vi utvecklat ytor med tydliga HA mönster för att studera interaktioner cancercell. Denna metod ger genomgående mönstrade ytor kompatibel med cellodling och analystekniker, inklusive men inte begränsat till immunofluorescerande färgning, svepelektronmikroskopi, hämning, migration etc.
Dessutom fotolitografiska metoder gör det enkelt mikrofabrikation någon önskade mönstret, för att kontrollera fixering av HA för specifika applikationer. Till exempel skulle fabricera PDMS frimärken med linjär ränder orörlig HA i en linjär array och kan vara användbart vid analys av cell migration längs mönstrade HA.
Även om vi har främst utnyttjat denna metod för att belysa samspelet cancercell med HA, är denna teknik tillämpas för att studera interaktioner med andra celltyper. Dessutom kan denna metod användas för att fixera ett brett utbud av HA-molekyler. HA vi har immobiliserade är fluorescerande med en molekylvikt på 800 kDa. Men HA varierar i storlek från 2000 - har 25 tusen repeterande disackarid enheter och cellulära svar visat sig vara beroende av HA molekylvikt 10-11. Detta protokoll kan därför tillämpas för att immobilisera HA av varierande molekylvikt för att undersöka cell svar på exogena HA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Video schematisk bild reproducerad med tillstånd, Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. rekonstruera differentiering nisch av embryonala stamceller med hjälp av biomaterial. Macromol. Biosci. 2010, 21 oktober. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Författarna medger användning av ytan analyslaboratorium vid Johns Hopkins, som finansieras som en del av Materials Research Science and Engineering Center genom National Science Foundation. LED är en IGERT praktikant och en National Science Foundation Fellow. Denna forskning har delvis stöd av NIH bidrag U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
