Summary
ووصف نهج الرواية التي تسمح للارتفاع القرار تحليل التفاعلات الخلايا السرطانية مع حمض الهيالورونيك الخارجية (HA). هي ملفقة السطوح منقوشة من خلال الجمع بين الكيمياء والطباعة carbodiimide microcontact.
Abstract
غزو السرطان والتقدم ينطوي على النمط الظاهري الخلية متحركة ، الذي يقع تحت تنظيم معقد من العوامل النمو / السيتوكينات ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل المكروية الورم. حمض الهيالورونيك (HA) هو مكون واحد ECM انسجة ما هو معروف لتسهيل تطور الورم عن طريق تعزيز الغزو ، والنمو ، والأوعية الدموية 1. تفاعل مع HA به مستقبلات سطح الخلية CD44 يدفع إشارة الأحداث التي تعزز نمو الخلايا السرطانية ، والبقاء والهجرة ، وبالتالي زيادة انتشار النقيلي 2-3. ها هو أنيوني ، جلايكان nonsulfated مؤلفة من تكرار وحدات من مد الغلوكورونيك الحامض وDN acetylglucosamine. بسبب وجود مجموعات الكربوكسيل والهيدروكسيل على وحدات ديساكهارايد التكرار ، ها هي الأم ماء إلى حد كبير وقابلة للتطبيق التعديلات الكيميائية التي الجماعات سلفات لاستيقاف photoreative 4-5. الدراسات السابقة التي تنطوي على immobilizations هكتار على السطوح الاستفادة من السلوك bioresistant هكتار ومشتقاته مكبرت للسيطرة على الالتصاق على السطوح الخلية 6-7. في هذه الدراسات يحدث التصاق الخلية تفضيلي منقوشة على مناطق غير ها.
لتحليل التفاعلات الخلوية مع HA الخارجية ، وضعنا functionalized السطوح المزخرفة التي تمكن من السيطرة عليها ودراسة عالية الدقة تصور التفاعلات الخلايا السرطانية مع HA. نحن الطباعة المستخدمة microcontact (UCP) لتحديد مناطق منفصلة منقوشة هكتار على السطوح الزجاجية. تم استخدام "الربط" النهج الذي ينطبق الكيمياء carbodiimide ربط شل HA 8. وكانت الواجهات الزجاجية microcontact المطبوعة مع aminosilane وردت مع حل HA النسب الأمثل للمركز وNHS لتمكين الشلل هكتار في صفائف منقوشة. تتضمن الكيمياء carbodiimide مع MCP تمكين تجميد هكتار إلى مناطق محددة ، وخلق المساحات المناسبة للتطبيقات في المختبر. كل من خلايا سرطان القولون وسرطان الثدي الخلايا تتفاعل ضمنا مع السطوح micropatterned HA. التصاق الخلايا السرطانية وقعت في غضون 24 ساعة مع انتشار لمدة 48 ساعة. HA الأسطح باستخدام micropatterned ، أثبتنا أن سرطان الخلية يحدث التصاق من خلال مستقبلات CD44 HA. وعلاوة على ذلك ، تم HA السطوح منقوشة متوافق مع المجهر الإلكتروني (SEM) وسمح القرار التصوير عالية من نتوءات الخلية السرطانية لاصقة ونشر على أنماط HA لتحليل حركية الخلية السرطانية على HA الخارجية.
Protocol
1. معيار الطباعة التصويرية للصناعات ختم Micropatterned
- شطف رقاقة السيليكون جديدة مع الإيثانول والجافة مع تيار من الهواء. استخدام ملقط للتعامل مع رقاقة ومنع عيوب السطح خلال العملية برمتها.
- نقل رقاقة تدور المغطي وتغطي سطح الرقاقة مع SU - 2025 مقاومة للضوء سلبية. تغطية ما لا يقل عن 80 ٪ من رقاقة مع مقاومة للضوء. معطف تدور لمدة 10 ثانية في 600rpm ، تليها 30 ثانية في 3000rpm. نظرا لحساسية للضوء ، إطفاء الأنوار غرفة من هذه النقطة إلى الأمام.
- نقل مقاومة للضوء المغلفة رقاقة السيليكون لوحة الساخنة "للخبز لينة" في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إزالته من لوحة الساخن ، والسماح لتبرد 1 دقيقة.
- وضع قناع الجاهزة مع نمط المطلوب على رأس رقاقة السيليكون مقاومة للضوء وفضح المغطاة إلى الأشعة فوق البنفسجية (UV) التشعيع (350-450 نانومتر) لمدة 20 ثانية.
- نقل رقاقة السيليكون لوحة الساخن ل"خبز بشدة" على 110 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
- بدوره عن الاضواء وإزالة رقاقة من صفيحة ساخنة. وينبغي أن تكون مرئية أنماط متميزة في هذه المرحلة.
- شطف بعناية مع رقاقة السيليكون SU - 8 المطور مقاومة للضوء. بعد 3 يشطف مع حل المطور ، وشطف مع الايثانول. وجدت بقايا البيض موجود ، كرر التشطيف مع الحل المطور مقاومة للضوء ، أو ببساطة يغرق الرقاقة في حل المطور لمدة 2 دقيقة ، والشروع من جديد مع الايثانول الشطف. يغسل بالماء والهواء الجاف.
- مزيج polydimethylsiloxane (PDMS) حل الاستومر وكيل علاج في نسبة الوزن 10:01. الطرد المركزي في 900rpm لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء.
- رقاقة منقوشة في مكان طبق بتري وتصب PDMS على رقاقة السيليكون. إذا كان هناك فقاعات الحاضر ، في مكان وفراغ desicator لبضع دقائق حتى تختفي فقاعات.
- علاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) لتشكيل ختم مطاطية التكميلية. إذا لم يتم PDMS شفي تماما بعد 12 ساعة ، ومكان في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة بعناية PDMS من رقاقة السيليكون. استخدام حافة الشائكة لخفض الدمغة إلى الحجم المطلوب. يصوتن في الإيثانول لمدة 15 دقيقة. ويمكن استخدام رقائق عدة مرات لإنشاء طوابع مطاطية جديدة.
2. HA Micropatterning
- البلازما تنظيف الزجاج الشرائح لمدة 5 دقائق. وضع كافة الشرائح في الغرفة والفراغ لمدة 5 دقائق. ثم السماح انخفاض تدفق الأوكسجين إلى دخول الغرفة. بدوره نظافة البلازما لمدة 5 دقائق. إزالة البلازما من أنظف ومكان في صحن بيتري باستخدام ملقط.
- أثناء تنظيف البلازما ، ويصوتن الطوابع PDMS في الإيثانول لمدة 15 دقيقة.
- إعداد الطازجة 3 ٪ V / V حل aminopropyltrimethoxysilane - 3 (APTMS) في 95 الإيثانول V / V ٪ في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. السماح للرد لمدة 5 دقائق على RT لتشكيل silanol.
- مكان PDMS ختم نمط المتابعة تدور حول المغطي تشاك وتغطية السطح مع منقوشة حل APTMS. Spincoat في 3500rpm لمدة 30 ثانية. لا تلمس السطح الطوابع ، الا ان الجانبين من الطوابع PDMS.
- نقل APTMS حل لتنظيف الواجهات الزجاجية البلازما : مجموعة الطوابع التي تواجه حملة على واحدة من نهاية الجانب المزخرفة وتنزلق برفق PDMS الملحة لذلك هو تماما في اتصال مع السطح الزجاجي لمدة 1 دقيقة.
- إزالة الختم PDMS بلطف ، والسماح للشريحة زجاجية منقوشة في لاحتضان RT لمدة 30 دقيقة. شطف السطوح منقوشة مع الإيثانول والهواء الجاف. يصوتن PDMS ختم لمدة 15 دقيقة لإزالة APTMS الزائدة.
- السطوح الحرارة في الفرن أو على طبق ساخن لمدة 1 ساعة في 115 درجة مئوية. التشطيف مع الإيثانول والجافة مع الهواء.
- اعداد جديدة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، سيلاني حل 20 ٪ V / V 2 -- [ميثوكسي (polyethyleneoxy) بروبيل] trimethoxysilane في التولوين. هذا سوف يكون بمثابة منطقة غير لاصقة المحيطة الأنماط.
- نقل شريحة زجاجية منقوشة على الزجاج طبق بتري واحتضانها في الربط بين حل سيلاني لمدة 45 دقيقة عند 75 درجة مئوية على طبق ساخن. التشطيف مع التولوين ، والمياه ، والجافة مع الهواء.
- تعقيم لمدة 1 ساعة باستخدام أشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم في خزانة السلامة البيولوجية. المضي قدما في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من هذه النقطة إلى الأمام للحفاظ على العقم.
- تحضير محلول مائي HA العقيمة.
10MM - 1 - 3 - الأثيل carbodiimide (3 - dimethylaminopropyl) (EDC)
5mM من N - hydroxysuccinimide
50μg / مل فلوريسئين المسمى HA - تطبيق حل HA إلى ركائز الزجاج المزخرف في ظروف معقمة ومحمية من الضوء. وينبغي أن تكون ركائز منقوشة دون عائق ل16-24 ساعة.
- نضح قبالة HA الحل ، مع غسل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، وتغطية السطح مع ألبومين المصل البقري 1 ٪ (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. سطح جاهز الآن للثقافة الخلية.
3. الثقافة خلية على السطوح Micropatterned HA
- توسيع MDA - MB - 231 سرطان الثدي البشرية والخلايا خلايا سرطان القولون والمستقيم LS174T ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تعليق البذور خلية واحدة من الخلايا السرطانية ذات الكثافة بين 0.4 و 1x10
- يمكن الحفاظ على سطوح الخلايا ثقافة تصل إلى 5 أيام في ظروف الحاضنة القياسية. تغير وسائل الاعلام كل يوم. ويمكن ملاحظة خلية التشكل والنمو باستخدام مجهر مقلوب الخفيفة. ويمكن تطبيق فحوصات إضافية لتحليل الخلوية الردود على سطح HA.
4. ممثل النتائج :
يظهر الكيمياء carbodiimide المستخدمة لشل حركة تساهميا HA على الشرائح الزجاجية المزخرفة APTMS 1A في الشكل. EDC هو عامل يشابك صفرية أن يتفاعل مع مجموعات الكربوكسيل HA لتشكيل أمين التفاعل سيطة. وهذا المتوسط هو عرضة للتحلل المائي ، إضافة إلى زيادة NHS carbodiimide كفاءة التفاعل. كما HA حل يتفاعل مع micropatterns APTMS والسندات أميد مستقرة بين أشكال وسيطة وHA الأمينات الأولية من ATPMS. تصور مثال على السطح المزخرف HA باستخدام المجهر الفلورسنت وكثافة مضان تحليل ImageJ إظهار نمط من الشلل HA ترد (الشكل 1B - C).
وmicropatterned السطوح HA تمكين دراسة التفاعلات الخلايا السرطانية مع HA expgenous. كلا MDA - MB - 231 LS174t الثدي البشرية وسرطان القولون خطوط الخلايا البشرية تلتزم بشكل تفضيلي إلى مناطق micropatterned HA (الشكل 2). ويمكن استخدام التصوير عالية القرار باستخدام المجهر الإلكتروني لتحليل التفاعلات بين الخلايا المستزرعة مع الأسطح HA يجمد (الشكل 3).
الشكل 1 HA micropatterned السطوح (أ) وصف تخطيطي لتطوير السطوح HA الوظيفية ، (B) من صورة مضان فلوريسئين (الخضراء) التي تحمل علامات HA micropatterned السطح. (C) 3D خريطة توزيع بكسل باستخدام البرمجيات ImageJ مما يدل على أنماط HA منفصلة. مقياس شريط = 100μm. تعديل في الفترة من 9 بإذن من السيفير.
الرقم 2 الخلايا السرطانية. التصاق على الأسطح micropatterned HA. كلا النقطتين (A) وسرطان الثدي (باء) سرطان تفضيلي على التقيد بقع HA مع 24 ساعة من الثقافة. تعديل في الفترة من 9 بإذن من السيفير.
الرقم الخلايا السرطانية 3. التفاعل مع HA. (أ) مسح الصور المجهر الإلكتروني للخلايا سرطان القولون (A) تربيتها على أسطح HA معروضة في التكبير المنخفض (يسار) والتكبير عالية (الحق ؛ من المربعات على اليسار) وخلايا سرطان الثدي (B) على الأسطح مثقف ها هو موضح في منخفضة التكبير (يسار) والتكبير عالية (الحق ؛ من المربعات على اليسار).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب يسمح micropatterning HA قدم دراسة التفاعلات الخلية مع HA الخارجية. ها هو معروف أن تلعب دورا رئيسيا في تطور سرطان 1 ومع ذلك كانت هناك دراسات محدودة تحقق التفاعل بين الخلايا السرطانية على اثنين من الأبعاد السطوح منقوشة HA. دراسة السيطرة على micropatterns HA خارجية تسمح برؤية عالية الدقة للالتصاق الخلايا السرطانية ، والنمو ، والهجرة ، ويمكن توضيح الأسس المزيد من السرطان.
من خلال الجمع بين الكيمياء والطباعة carbodiimide microcontact ، قمنا بتطوير أنماط السطوح مع HA متميزة لدراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية. هذا الأسلوب يسمح باستمرار السطوح منقوشة متوافق مع خلية ثقافة وتقنيات التحليل بما في ذلك ، ولكن لا تقتصر على تلوين مناعي ، المجهر الالكتروني ، وتثبيط ، والهجرة ، الخ.
بالإضافة إلى ذلك ، وتقنيات الطباعة بصفائح معدة ضوئيا تسمح التصنيع الدقيق من أي نمط من السهل المطلوب ، للسيطرة على تجميد HA لتطبيقات محددة. على سبيل المثال ، فإن افتعال الطوابع PDMS بخطوط شل خطي HA في مجموعة خطية ، ويمكن أن تكون مفيدة في تحليل الهجرة على طول الخلية HA منقوشة.
على الرغم من أننا قد تستخدم هذه الطريقة في المقام الأول لتوضيح تفاعلات الخلايا السرطانية مع ها ، هذه التقنية قابلة للتطبيق لدراسة التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا الأسلوب في شل مجموعة واسعة من الجزيئات HA. هو fluorescently المسمى على HA دينا ثبتوا مع الوزن الجزيئي من 800 كيلو دالتون. ومع ذلك ، ها تتراوح في حجمها من 2000 -- وقد تجلى 25000 وحدات ديساكهارايد التكرار ، والاستجابة الخلوية لأنها تعتمد على الوزن الجزيئي HA 10-11. ولذلك يمكن أن يطبق هذا البروتوكول في شل HA متفاوتة الأوزان الجزيئية للتحقيق في استجابة الخلايا لHA الخارجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الفيديو الشكل التخطيطي مستنسخة بإذن ؛ حقوق الطبع والنشر ايلي VCH دار GMBH & KGaA شركة. ديكنسون جنيه ، كوسوما S ، S. غرشت إعادة بناء مكانة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام المواد الحيوية. Macromol. Biosci. 2010 ؛ 21 أكتوبر. [EPUB قبل الطباعة].
Acknowledgments
الكتاب يقر استخدام سطح مختبر التحليل في جامعة جونز هوبكنز ، الذي تموله كجزء من العلوم ومركز بحوث المواد الهندسية من خلال مؤسسة العلوم الوطنية. الصمام هو متدرب IGERT والوطنية للعلوم زميل مؤسسة عليا. وأيد هذا البحث جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
