Summary
Un nuovo approccio che consente l'analisi ad alta risoluzione delle interazioni delle cellule tumorali con esogeno di acido ialuronico (HA) è descritto. Superficie lavorata sono realizzati mediante la combinazione chimica carbodiimmide e stampa microcontact.
Abstract
Invasione del cancro e nella progressione comporta un fenotipo delle cellule mobili, che è sotto regolamentazione complessa da fattori di crescita / citochine e della matrice extracellulare (ECM) componenti all'interno del microambiente tumorale. L'acido ialuronico (HA) è una componente stromale ECM che è noto per facilitare la progressione del tumore con invasione migliorando, la crescita e l'angiogenesi 1. Interazione di HA con la sua superficie CD44 delle cellule del recettore induce segnalazione di eventi che promuovono la crescita delle cellule tumorali, la sopravvivenza e la migrazione, aumentando così la diffusione metastatica 2-3. HA è uno anionico, glicosamminoglicani nonsulfated composta da unità ripetute di D-glucuronico e DN-acetilglucosamina. A causa della presenza di gruppi carbossilici ed idrossilici sulle unità disaccaride ripetere, HA nativo è in gran parte idrofila e suscettibili di modificazioni chimiche che introducono i gruppi solfato per l'immobilizzazione photoreative 4-5. Gli studi precedenti relativi al immobilizzazioni di HA su superfici utilizzare il comportamento bioresistant di HA e il suo derivato solfato di controllare l'adesione cellulare su superfici 6-7. In questi studi l'adesione cellulare avviene principalmente sulla non-HA regioni fantasia.
Per analizzare le interazioni cellulari con HA esogeni, abbiamo sviluppato fantasia superfici funzionalizzate che permettono uno studio controllabile e ad alta risoluzione la visualizzazione delle interazioni delle cellule tumorali con HA. Abbiamo utilizzato stampa microcontact (UCP) per definire le regioni discreta fantasia di HA sulle superfici di vetro. Un approccio "tethering", che applica la chimica carbodiimmide collegamento a immobilizzare HA è stato usato 8. Superfici vetrate sono state microcontatto stampato con un aminosilane e ha reagito con una soluzione HA di rapporti ottimizzata di EDC e NHS per permettere HA immobilizzazione in array fantasia. Incorporando chimica carbodiimmide con MCP consentito l'immobilizzazione di HA per regioni definite, la creazione di superfici adatte per applicazioni in vitro. Entrambe le cellule del cancro del colon e le cellule cancerogene del seno implicitamente interagito con le superfici micropatterned HA. Adesione delle cellule del cancro si è verificata entro 24 ore con la proliferazione di 48 ore. Utilizzando HA superfici micropatterned, abbiamo dimostrato che l'adesione delle cellule tumorali avviene attraverso il recettore CD44 HA. Inoltre, HA superficie lavorata erano compatibili con la microscopia elettronica a scansione (SEM) e ha permesso di imaging ad alta risoluzione di sporgenze cellula tumorale adesivo e la diffusione su modelli di HA per analizzare la motilità delle cellule tumorali in HA esogeni.
Protocol
1. Fotolitografia standard per la fabbricazione Timbro Micropatterned
- Risciacquare un wafer di silicio nuovo con etanolo e asciugare con flusso d'aria. Utilizzare pinze wafer e prevenire i difetti superficiali durante l'intero processo.
- Trasferimento wafer a girare verniciatore e coprire superficie del wafer con SU-2025 photoresist negativo. Coprire almeno l'80% dei wafer con photoresist. Cappotto Spin per 10 secondi a 600rpm, seguito da 30 secondi a 3000rpm. A causa della fotosensibilità del photoresist, spegnere le luci della stanza da questo punto in avanti.
- Trasferimento photoresist wafer al silicio a piastra calda per "soft-bake" a 95 ° C per 3 minuti. Togliere dal fornello e lasciare 1 minuto per raffreddare.
- Posizionare un prefabbricato maschera con il modello voluto sulla parte superiore del photoresist coperte wafer di silicio ed esporre ai raggi ultravioletti (UV) irradiazione (350-450 nm) per 20 secondi.
- Trasferimento wafer di silicio a piastra calda per "hard-bake" a 110 ° C per 6 minuti.
- Accendere le luci e rimuovere wafer da piastra riscaldante. Modelli distinti dovrebbe essere visibile a questo punto.
- Risciacquare accuratamente wafer di silicio con SU-8 sviluppatore photoresist. Dopo 3 lavaggi con soluzione di sviluppo, risciacquare con etanolo. Se qualche residuo bianco è presente, ripetere sciacquare con soluzione di sviluppo photoresist, o semplicemente immergere il wafer in soluzione di sviluppo per 2 minuti e procedere di nuovo con etanolo risciacquare. Lavare con acqua e aria secca.
- Mix polidimetilsilossano (PDMS) soluzione elastomero e catalizzatore in un rapporto di 10:1 peso. Centrifugare a 900rpm per 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
- Luogo fantasia wafer in piastra di Petri e versare PDMS su wafer di silicio. Se ci sono bolle presenti, mettere in desicator e vuoto per un paio di minuti fino a quando bolle scompaiono.
- Cure notte a temperatura ambiente (RT) per formare un timbro complementare elastomerico. PDMS se non è completamente guarito dopo 12 ore, mettere in forno a 60 ° C per 30 minuti.
- Rimuovere con attenzione PDMS da wafer di silicio. Utilizzare un bordo di rasoio per tagliare timbro alla misura desiderata. Sonicare in etanolo per 15 minuti. Wafer può essere utilizzato più volte per creare nuovi francobolli elastomerico.
2. HA micropatterning
- Plasma vetro pulito i vetrini per 5 minuti. Mettere tutti i vetrini in camera e vuoto per 5 minuti. Quindi consentire a basso flusso di ossigeno di entrare camera. Accendere più pulito al plasma per 5 minuti. Togliere dal più pulito al plasma e posto in una piastra di Petri con pinze.
- Durante la pulizia al plasma, sonicare francobolli PDMS in etanolo per 15 minuti.
- Preparare una fresca 3% v / v soluzione di 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) nel 95% v / v di etanolo in una provetta da centrifuga 15 mL. Lasciare agire per 5 minuti a temperatura ambiente per formare un silanolo.
- Luogo timbro PDMS modello-up, spin coater mandrino e coprire fantasia superficie con una soluzione APTMS. Spincoat a 3500rpm per 30 secondi. Non toccare la superficie del francobollo, solo i lati del timbro PDMS.
- Trasferire la soluzione APTMS al plasma pulire superfici vetrate: timbro set rivolto verso il basso su una delle estremità del lato a motivi geometrici e scivolano dolcemente premendo PDMS in modo che sia completamente a contatto con la superficie del vetro per 1 minuto.
- Rimuovere PDMS timbro delicatamente, e consentire vetrino fantasia ad incubare a RT per 30 minuti. Sciacquare superficie lavorata con etanolo e aria secca. Sonicare PDMS bollo per 15 minuti per rimuovere APTMS in eccesso.
- Superfici di calore nel forno o sulla piastra calda per 1 ora a 115 ° C. Sciacquare con etanolo e asciugare con aria.
- Preparare fresca polietilene glicole (PEG)-silano soluzione del 20% v / v 2 - [metossi (polyethyleneoxy) propil] trimetossisilano in toluene. Questo servirà come un non-adesivo regione circostante modelli.
- Trasferimento vetrino fantasia per un piatto di vetro Petri e incubare PEG-silano soluzione per 45 minuti a 75 ° C su una piastra calda. Risciacquare con toluene, l'acqua e asciugare con aria.
- Sterilizzare per 1 ora con irradiazione UV germicida in una cappa di sicurezza biologica. Procedere in cappa di sicurezza biologica da questo punto in avanti per mantenere la sterilità.
- Preparare una soluzione acquosa sterile HA.
10mM di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC)
5mm di N-hydroxysuccinimide
50μg / mL marcato con fluoresceina HA - Applicare la soluzione HA substrati di vetro per la fantasia in condizioni sterili e protetto dalla luce. Fantasia substrati devono essere indisturbato per 16-24 ore.
- Aspirare off soluzione HA, lavare con soluzione salina tampone fosfato (PBS), e coprire la superficie con 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 1 ora. La superficie è ora pronto per colture cellulari.
3. Coltura cellulare su superfici HA Micropatterned
- Espandere MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno e LS174T cellule di carcinoma del colon-retto, secondo le istruzioni del produttore.
- Semi di sospensioni cellulari di cellule tumorali con densità compresa tra 0,4 e 1x10
- Superfici di colture cellulari possono essere mantenuti fino a 5 giorni in condizioni standard di incubatore. Cambiare i media a giorni alterni. Morfologia cellulare e la crescita può essere osservato con microscopio invertito la luce. Ulteriori test cellulare può essere applicato per analizzare le risposte alla superficie HA.
4. Rappresentante dei risultati:
La chimica carbodiimmide utilizzato per immobilizzare covalentemente alla HA APTMS vetrini fantasia è mostrato nella Figura 1A. EDC è di lunghezza zero Reticolante che reagisce con HA gruppi carbossilici per formare ammine reattivi intermedi. Dato che questo intermedio è suscettibile all'idrolisi, NHS viene aggiunto per aumentare l'efficienza carbodiimide reazione. Come soluzione HA interagisce con microdisegni APTMS, una stalla forme ammide legame tra HA intermedi e ammine primarie di ATPMS. Un esempio di superficie HA fantasia visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza e una intensità di fluorescenza ImageJ analisi dimostrano l'immobilizzazione fantasia di HA sono mostrati (Figura 1B-C).
Le superfici micropatterned HA permettere lo studio delle interazioni delle cellule tumorali con HA expgenous. Entrambi MDA-MB-231 materno e LS174t del colon umano linee di cellule tumorali preferenzialmente aderire HA regioni micropatterned (Figura 2). Imaging ad alta risoluzione usando la microscopia elettronica a scansione può essere usato per analizzare le interazioni delle cellule in coltura con superfici HA immobilizzata (Figura 3).
Figura 1 HA superfici micropatterned (A) Schema che descrive lo sviluppo di superfici HA funzionale, (B) immagine di fluorescenza di fluoresceina (verde)-etichettati HA superficie micropatterned. (C) mappa di distribuzione dei pixel 3D utilizzando il software ImageJ dimostrano i modelli HA discreto. Barra di scala = 100μm. Modificato da 9 con il permesso di Elsevier.
Figura 2. Adesione delle cellule del cancro in HA superfici micropatterned. Entrambi i due punti (A) e della mammella (B) carcinoma preferenzialmente aderito su patch HA con 24 ore di cultura. Modificato da 9 con il permesso di Elsevier.
Figura 3. Cellule interazione Cancro con HA. (A) Acquisizione di immagini di microscopia elettronica delle cellule del cancro del colon (A), coltivati su superfici HA mostrato a basso ingrandimento (a sinistra) e ad alto ingrandimento (a destra; di quadrati sulla sinistra) e delle cellule di cancro al seno (B), coltivati su superfici HA mostrato a basso ingrandimento (a sinistra) e ad alto ingrandimento (a destra; di quadrati a sinistra).
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Discussion
Il metodo micropatterning HA presentato permette lo studio delle interazioni delle cellule con HA esogeni. HA è nota per svolgere un ruolo chiave nella progressione del cancro 1 Tuttavia ci sono stati studi limitati indagare l'interazione delle cellule tumorali in due dimensioni HA superficie lavorata. Uno studio controllabile sul esogeni microdisegni HA ad alta risoluzione permette la visualizzazione di adesione delle cellule tumorali, la crescita e la migrazione e possono ulteriormente chiarire fondamenti di cancro.
Grazie alla combinazione chimica carbodiimmide e stampa microcontact, abbiamo sviluppato superfici con motivi HA distinti per studiare le interazioni delle cellule tumorali. Questo metodo permette di superfici costantemente modellata compatibile con le colture cellulari e tecniche di analisi tra cui, ma non limitato a colorazione immunofluorescenza, microscopia elettronica a scansione, inibizione, migrazione, ecc
Inoltre, le tecniche di fotolitografia permettono di microfabbricazione facile di qualsiasi modello desiderato, per controllare immobilizzazione di HA per applicazioni specifiche. Per esempio, fabbricazione di timbri PDMS con strisce lineare sarebbe immobilizzare HA in un array lineare e può essere utile per analizzare la migrazione delle cellule lungo fantasia HA.
Anche se abbiamo principalmente utilizzato questo metodo per chiarire le interazioni delle cellule tumorali con HA, questa tecnica è applicabile per studiare le interazioni con altri tipi di cellule. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per immobilizzare una vasta gamma di molecole di HA. HA abbiamo immobilizzato è fluorescente con un peso molecolare di 800 kDa. Tuttavia, intervalli di HA di dimensione 2000-25000 unità disaccaridiche ripetute e risposta cellulare ha dimostrato di essere dipendenti dal peso molecolare HA 10-11. Questo protocollo può quindi essere applicato a immobilizzare HA di vario peso molecolare per studiare la risposta cellulare al HA esogeni.
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Disclosures
Video figura schematica riprodotto con il permesso; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Ricostruire la nicchia differenziazione delle cellule staminali embrionali con biomateriali. Macromolecole. Biosci. 2010; 21 ottobre. [Epub davanti alla stampa].
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'uso del laboratorio di analisi di superficie presso la Johns Hopkins, finanziato nell'ambito della Ricerca Scientifica Materiali e Ingegneria Centro attraverso la National Science Foundation. LED è un tirocinante IGERT e un National Science Foundation Graduate Fellow. Questa ricerca è stata in parte sostenuto da NIH concedere U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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