Summary
Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür sunmak
Abstract
Biz in vitro heterojen üç boyutlu tümör dokulara teslimat ve ilaçların sistemik klirensi taklit eden bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Damar tarafından teslim Besinler canlı, sakin ve nekrotik hücre tipleri oluşan heterojen mikroçevrelerde sebebiyet veren tümörler tüm bölümlerine ulaşmak için başarısız. Birçok kanser ilaçlarının etkili hücreleri nedeniyle bu heterojenlik her türlü nüfuz ve tedavisinde başarısız. Kanser hücrelerinin tek katmanlarını zor in vitro model bir uygun olan kanser ilaçlarının test etmek için yapma, bu heterojen taklit ederler. Bizim mikroakışkan cihazları yumuşak litografi kullanarak PDMS üzerinden hazırlandı. Asılı damla yöntemi ile oluşturulan Multisellüler tümör sferoidler, eklenen ve kısıtlı cihaz üzerinde dikdörtgen odasına ve bir tarafta sürekli orta perfüzyon ile muhafaza edildi. Cihazda odaları dikdörtgen doku içinde doğrusal basamaklara yarattı. Floresan lekeleri inci ölçmek için kullanılmıştırdokusu içinde apoptozis e değişkenliği. Cihazda Tümörler floresan kemoterapötik ilaç doksorubisin, time-lapse mikroskopi doku içine onun difüzyon izlemek için kullanılan ve etkin difüzyon katsayısı tahmin edilmiştir ile tedavi edildi. Asılı damla yöntemi çeşitli kanser hücre hatları düzgün sferoidlerin hızlı oluşumunu sağladı. Cihaz en fazla 3 gün için sferoidlerin büyüme sağladı. Orta akan yakınlığı Hücreleri minimal apoptotik vardı ve bu çok kanaldan böylece doğru kan damarları komşu tümörlerde bölgelerde taklit, daha apoptotik vardı. Doksorubisin difüzyon katsayısının tahmini değeri insan meme kanseri daha önceden bildirilen değeri ile anlaştılar. Solid tümörler ilaç penetrasyonu ve kalıcılık onların etkinliğini etkilediği için, bu cihazın uyuşturucu davranışını anlamak ve yeni kanser tedavi geliştirilmesinde önemli bir araç olduğuna inanıyoruz.
Protocol
1. Cihaz İmalatı
Elastomerik malzemeler içinde mikroakış özellikleri çoğaltma Duffy ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda dayanır. 1
- Karışım elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) ile 9:1 ağırlık oranında silikon elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) sertleştirme maddesi ve 4 mm kalınlığında bir katman oluşturmak için ana üzerine dökün. Degas, 5 saat boyunca 60 ° C 'de hava kabarcıklarını çıkarmak ve karışım tedavi etmek. Peel Elastomer üzerindeki akış özellikleri bir damga elde etmek için kalıp PDMS tedavi.
- 1.5 mm biyopsi yumruk (Miltex, York, PA) kullanılarak giriş ve çıkışları için Punch delik bir matkap basın üzerine monte. Herhangi bir enkaz dışarı çekin.
- Damga özellikleri yan ve bir oksijen plazma yakıcısı 8 dakika oksijen plazma temiz bir cam slayt koşuluyla. Bunların arasında bir bağ oluşturmak üzere hemen temas içinde muameleye tabi olan yüzeylerde getirin. En az 5 saat süreyle sıcak bir slayt üzerine 60 ° C'de montaj koruyuns bağı güçlendirmek için.
- Dikenli dişi luer lock konnektör (Qosina, Edgewood, NY) bağlı erkek luer kilit bir arabirim konnektörleri kullanarak giriş ve çıkışları için 0.032 "ID PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) bağlayın.
- Vafleri ve bir Y-konnektör (; Şekil 1 Upchurch Bilimsel, Oak Harbor, WA) kullanarak akış montaj ayarlayın. Mikroskop cihazı monte edin. 20G 1.5 "iğne (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak tüp için şırınga takın.
2. Üniforma sferoidlerin Oluşumu
Sferoidler asılı damla yöntemi 2,3 oluşturulmuştur.
- Steril bir hücre kültürü kaputu altında hücreleri Trypsinize.
- 5 dakika boyunca 2000 rpm'de santrifüje hücreler tripsinize ve 6 ml taze ortam içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Istenen bir nihai konsantrasyon (Tablo 1) stok çözeltisi ile seyreltilir.
- 48 kuyu plaka kapağını çıkarın ve ste baş aşağı yerleştirinkaput rilized. Her iyi karşılık Genelgesi bölgelerde kapağında görülür. Nemi korumak için sterilize 1 mL su ile plakanın her doldurun. Bir mikropipet kullanılarak her bir dairesel bölge içinde seyreltilmiş hücre solüsyonu 20 ul damlacık koyun. Dikkatli bir şekilde kapağı ters çevirin ve damla kuyuların kenarlarına dokunmayın sağlanması, plaka üzerine yerleştirin.
- Belirli bir gün sayısı (Tablo 1) için 37 ° C'da plaka inkübe edin. Bir sfero Her asılı damla oluşturacaktır.
3. Cihaz içine sferoidlerin Giriş
Bu bölüm için 1 ve Tablo 2 Şekil bakın.
- Akış giriş aracılığıyla uygulamaya% 70 etanol ile yıkama yoluyla sterilize cihaz. PBS hücre besiyerinin tamponlu HEPES izledi sahip sonra, yıkayın. Tüp bağlı orta şırınga S F bırakın.
- Şırınga S P içine 2-3 sferoidler çizin, hava kabarcıklarını çıkarmak için şırınga dokunun veCihazın ambalaj giriş bağlanırlar.
- Açık giriş vanası V Pin ve yakın V Fin. Aç çıkış valfi V Pout ve yakın V Fçıkış. Aşağı doğru iğne ile dikey paketleme şırıngayı tutun; sferoidlerin iğne luer lock konnektör içine şırınga altına yerleşmek gibi izleyebilirsiniz. Ambalaj şırınga ve izlemek sferoidler üzerindeki pimi itin cihazın içine boru ve akış girin. Ancak ambalaj çıkış valfı açık olduğundan, bir küremsi cihazın odasına girer ve arka (Şekil 2) ileti korunabilir.
- Kapat giriş vanası V Pin ve çıkış vanası V Pout. Bir şırınga pompası üzerinde şırınga S F monte edin. Açık vana V Fin ve vana V Fçıkış. 3 ul / dk akış cihaz içine ortamı.
4. Apoptoz algılama Agent Giriş (CaspGLOW)
Sferoidler sahip odaları ambalaj sonra, u için dengeleme izintespit apoptozis veya terapötik ajanlar tanıtmadan önce, besin gradyanlar ve mikroçevrelerde kurmak için 24 saat s. Odasındaki doku üst ve alt delinmez duvarları ile temas halinde oldukları için, doku kalınlığı boyunca hiçbir besin eğimleri (0,15) bulunmaktadır. 24 saatlik inkübasyon sonrasında doku kalınlığı boyunca hücre tabakaları bu nedenle eşdeğerdir ve sadece heterojen uzağa akış kanalından bir yönde.
- V Fin kapatın, şırınga pompası durdurmak, pompa şırınga S F kaldırmak ve 0.25 ul / CaspGLOW Kırmızı Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (Kırmızı-DEVD-FMK ml içeren orta olan bir şırınga ile değiştirin; Biovision, Mountain View, CA).
- El ile büyük orta yerinden sağlamak için aygıt ile bu çözeltinin 0.7 ml yıkayın. , Pompa üzerinde şırınga monte akışını yeniden başlatın ve açık V Fin. 5-8 saatlik bir süre içinde, apoptoz t içine ajan diffüze tespitO doku ve apoptotik bölgelerinde parlak fluoresces. Bu konsantrasyonda Apoptoz tespit ajan cihaza sonraki tüm akış çözümleri korunur.
Not:
- Doku heterojenlik Bölüm 6'da tarif edildiği gibi flöresan doğrusal yoğunluk profilleri elde ile teyit edilebilir. Profiller doku hücre canlılığı açısından heterojen olduğunu doğrulayarak, apoptoz mekansal degradeleri göstermelidir.
- CaspGLOW Green Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (fluorescein-DEVD-FMK; Biovision) aynı zamanda apoptoz tespit etmek için de kullanılabilir. Bu işaretleyici yerine kırmızı fluorofor rodamin arasında yeşil fluorofor floresein içerir.
5. Terapötik Ajan Tanıtımı
- Ajan tespit apoptoz içeren; 10 uM doksorubisin hidroklorür (Sigma-Aldrich, St Louis, MO Dox) tanıtmak için adımlar 4,1-4,2 bulunan yordamı izleyin.
- Therape akışı devamzaman sabit bir süre için utic ajan çözeltisi. Vana V Fin kapatın ve şırınga pompası kapatın. Ajan tespit apoptoz içeren taze orta şırınga ile tedavi şırınga değiştirin. Sürekli mikroskop altında doku izlerken 24 -36 saat süreyle taze orta akışı sağlayın.
6. İlaç Diffüzivite Katsayıları Time-lapse Mikroskopi ve Kestirim
Temiz floresans verileri elde etmek için, dokuların alt katmanları üzerinde mikroskop odaklanarak tüm görüntüleri elde. Dikey yönde hiçbir besin eğimleri (bakınız Bölüm 4) olduğundan, hücrelerin alt tabakaları üzerindeki tüm diğer tabakaların iyi temsilcileridir.
- Tüm satın alma süreci IPLab bir özelleştirilmiş komut (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak otomasyona geçilmiştir. 10x büyütmede dolu spheroid her 30 dakikada bir (Şekil 3A) iletilen ışık ve floresans görüntüler elde edin. Acquirönceki Dox tanıtılması için arka plan floresan e bir görüntü. Odanın büyüklüğü (1000 mikron x 300 mikron) için yerleştirmek için, iki komşu görüntüleri ve birlikte çini onları 4 kazanır.
- Ilacın difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini için, ilk adım ImageJ kullanarak Dox floresans ortalama lineer yoğunluğu profilleri üretmektir. Odasında doku kapsayan ilgi dikdörtgen bir bölge (ROI) seçin. Akış kanalından mesafenin bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunlukları bir profil oluşturmak için Plot profili komutunu kullanın. 3 adede kadar farklı zaman noktaları için tekrarlayın.
- Dokudan otofloresans ölçmek için Dox tanıtmadan önce bir arka plan floresan görüntüsü elde edin. Elde edilen yoğunluğu profillerden ortalama arka plan floresan yoğunluğu çıkarma ve elde etmek için gelen maksimum yoğunluğu her profili normale
(X, t) (Şekil 3B). - Bir sonraki adım, tümör dokusu içinde Dox etkili bir difüzyon katsayısı D değerlendirmektir. Dox difüzyon aşağıdaki denklem 5 ile temsil edilebilir
TÜMHATAİŞLEV tamamlayıcı hata fonksiyonu olduğu, x kanaldan doku içine mesafe ve t Dox tanıtılması (Şekil. 3'e bakın) sonra zaman. Ele alındığında her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şeması kullanın:- D için bir ne olacağını tahmin
- Her yerde, x eşitliğin sağ tarafına hesaplayın
- İki taraf arasındaki karesi hataların toplamı (rezidü) hesaplayın
- Kalıntı en aza indirmek için D değiştirme
- Ortalama dokuda Dox arasında ortalama etkin difüzyon katsayısı tahmin etmek her zaman noktasında alınan D optimum değerleri.
(X, t) (Şekil 3B). 
7. Temsilcisi Sonuçlar:
<p class = "jove_content"> mikroakışkan cihazlar 1mm verilmedi x 0.3mm x 0.15mm optik üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için erişilebilir kültürü odaları. Çok hücreli tümör sferoidler bu odaların içine uçakla edildi ve arka iki filtre mesajlarını tarafından muhafaza edildi. Asılı damla yönteminde, tutarlı bir boyut ve çeşitli hücre hatlarından şekilli parçacıkları arasında hızlı oluşumunu sağlamıştır. 3 güne kadar sferoidler için başarılı bir aygıt üzerinde yetiştirilmiştir. Odacıklarda Büyüme sferoidlerin içinde mikroçevrelerde bir tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkili bulunmuştur. Apoptosis, akış kanalı ve doku içine daha yüksek bir derin bir yakınlık içinde hücrelerinde daha az olmuştur. Cihaz, tümör dokusunda doksorubisin difüzyon katsayısı tahmin etmek için kullanıldı. 8.75 x 10 -7 cm 2 s -1 elde edilen değerin 9.1 değeri ile aynı fikirde x 10 -7 cm 2 s -1 insan meme kanseri daha önce 6. Min.| Hücre Hattı | Gerekli Hücre Konsantrasyon | İnkübasyon Süresi |
| LS174T | 300 hücre / ml ' | 2-3 gün |
| T47D | 750 hücre / ml ' | 3-4 gün |
| MDA-MB-231 | 150 hücre / mcL | 5-6 gün |
Asılı Damla sferoidler için Tablo 1. Parametreler
| Kısım | Tanım |
| S F | Akış Şırınga |
| S P | Şırınga Ambalaj |
| V Fin | Akış Giriş Valfi |
| V Pin | Giriş Valfi Ambalaj |
| V Fçıkış | Akış Outlet Vana |
| V Pout | Outlet Vana Paketleme |
Akışı Kurulumu Tablo 2. Enjektörler ve Vanalar
Şekil 1 akışını kurulum V Fin ve V Fçıkış şematik:. Akış giriş ve çıkış valfleri, V Pin ve V Pout: Ambalaj giriş ve çıkış valfleri, S F ve S P: Akış ve ambalaj şırınga. Bir sfero odasına uçakla olduğunda ambalaj şırınga ve giriş ve çıkış vanalarının ambalaj kullanılmaktadır. Akış şırınga ve akım giriş ve çıkış valfleri daha sonra orta akış için kullanılır.
Şekil 2. Cihaz üzerinde bir çember içinde sıkışıp kalmış bir spheroid şematik. A spheroid cihazda odasına akar ve iki filtre pos tarafından engellendiOdanın arka ts.
Şekil 3,. Cihaz üzerinde tümör dokusunda Doksorubisin difüzyon. A. doksorubisin yerini ve konsantrasyon (kırmızı) gösteren, doku iletilen ışık ve kırmızı floresan görüntü birleştirilmiştir. Ölçek çubuğu 250 mikron temsil eder. Doksorubisin floresansı B. Normalize lineer yoğunluk profili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümörlerde damar seyrek ve kötü 7,8 geliştirdi. Damar 9 olsa sağlanan besinler ve ilaçlar için ulaşılmaz olan kan damarlarından (> 100 mikron) uzakta bulunan bölgeler vardır. Sonuçtaki heterojen mikroçevrede birçok kemoterapötik 10 sınırlı etkinliğe katkıda bulunmaktadır. Burada geliştirilen mikroakışkan cihaz in vitro, sakin ve apoptotik ya da nekrotik hücre genişlemesi ile karakterize heterojen bir tümör mikro yaratır. Kanalın yakınlık hücreler, uygun olan, fakat difüzyon sınırlama çok kanaldan beslenme açısından eksik apoptotik bölgeler meydana getirirler. Akış kanalı, bir kan damarı temsil eder ve küremsi bir kan damarı bitişik bir tümör içinde küçük bir bölgede temsil eder.
Cihazın içine sferoidler tanıtırken herhangi bir engel doku akmasına, çünkü yumruk giriş deliğine temiz ve pisliklerden arınmış olmasını sağlamakbölme, ve kırık küremsi doldurmak başarısızlığa neden olacaktır. Ambalaj şırınga sferoidlerin tanıtılması sürecinde manuel olarak çalıştırılır. Akış hızı odanın arka mesaj ile küremsi itme önlemek için mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Tüm mikroakışkan cihazları gibi, bazı önlemler şırıngalar anahtarlama, özellikle sistem kabarcıkları önlemek için alınmalıdır. Bir şırınga her açıldığında kabarcıkları önlemeye yardımcı olacaktır tüp küçük bir parça kesme.
Tek bir deneyde birden odaları ve çoklu tedavilerin kullanımına izin vermek için cihaza Değişiklikler devam etmektedir. Biz bu cihazlar solid tümörler, mevcut kanser tedavi davranışını anlamak için kullanılabilir inanıyoruz. Aynı zamanda, yeni kanser tedavilerinin geliştirilmesi için ilaç tarama platform oluşturmak için kolay bir şekilde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü # 1R01CA120825-01A1, Massachusetts Amherst Üniversitesi İşbirlikçi Biyomedikal Araştırma (CBR) Programı ve Bhushan J. Toley için Isenberg Bursu ile desteklenmiştir. Biz minnetle James Schafer, kameramanların, anlatıcı ve bu video editörü değerli katkısını kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
