Summary
एक microfluidic युक्ति है कि विषम ट्यूमर microenvironments recreates के निर्माण और संचालन के लिए प्रक्रिया उपस्थित
Abstract
हम एक microfluidic युक्ति है कि वितरण और इन विट्रो में विषम तीन आयामी ट्यूमर ऊतकों दवाओं के प्रणालीगत निकासी mimics विकसित किया है. पोषक तत्वों vasculature द्वारा वितरित ट्यूमर के सभी भागों तक पहुँचने, विषम व्यवहार्य, मौन और परिगलित सेल प्रकार के मिलकर microenvironments को जन्म देने में असमर्थ है. कई कैंसर दवाओं को प्रभावी ढंग से घुसना और कोशिकाओं के इस विविधता के कारण सभी प्रकार का इलाज करने में विफल है. कैंसर कोशिकाओं के monolayers इस विजातिता नहीं की नकल है, इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त के साथ कैंसर दवाओं का परीक्षण करने के लिए मुश्किल बना. हमारे microfluidic उपकरणों PDMS की गढ़े गए थे नरम लिथोग्राफी का उपयोग. Multicellular ट्यूमर spheroids, हैंगिंग ड्रॉप विधि द्वारा गठित, डाला और विवश और डिवाइस पर आयताकार कक्षों में एक तरफ लगातार मध्यम छिड़काव के साथ बनाए रखा. डिवाइस पर कक्षों के आयताकार आकार ऊतक के भीतर रैखिक gradients बनाया. प्रतिदीप्त दाग वें मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया गयाऊतक के भीतर apoptosis में ई परिवर्तनशीलता. डिवाइस पर ट्यूमर फ्लोरोसेंट chemotherapeutic दवा डॉक्सोरूबिसिन, माइक्रोस्कोपी समय चूक ऊतक में अपनी प्रसार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और प्रभावी गुणांक प्रसार का अनुमान किया गया था के साथ इलाज किया गया. हैंगिंग ड्रॉप विधि कई कैंसर कोशिका लाइनों से वर्दी spheroids के जल्दी गठन की अनुमति दी. युक्ति 3 दिन के लिए spheroids के विकास को सक्षम होना चाहिए. मध्यम बहने की निकटता में कोशिकाओं न्यूनतम apoptotic थे और चैनल से दूर उन apoptotic थे, जिससे सही आसन्न ट्यूमर में रक्त वाहिकाओं के लिए क्षेत्रों की नकल उतार. डॉक्सोरूबिसिन प्रसार गुणांक के अनुमानित मूल्य मानव स्तन कैंसर में एक मूल्य के साथ पहले की रिपोर्ट पर सहमत हुए. क्योंकि पैठ और ठोस ट्यूमर में प्रतिधारण दवाओं की उनकी प्रभावकारिता को प्रभावित करता है, हमें विश्वास है कि इस डिवाइस दवाओं के व्यवहार को समझने और नए कैंसर चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक महत्वपूर्ण उपकरण है.
Protocol
1. डिवाइस फेब्रिकेशन
Elastomeric सामग्री में microfluidic सुविधाओं की प्रतिकृति डफी एट अल द्वारा वर्णित विधि के आधार पर किया गया था 1.
- मिक्स (polydimethylsiloxane, PDMS) elastomer और एक 9:01 वजन अनुपात में सिलिकॉन elastomer किट (डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) से इलाज के एजेंट और एक 4 मिमी मोटी परत के रूप में करने के लिए मास्टर डालना. Degas हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए और इस मिश्रण का इलाज 5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर. पील आचारण से PDMS ठीक elastomer पर प्रवाह सुविधाओं का एक डाक टिकट प्राप्त.
- Inlets और दुकानों का उपयोग कर एक 1.5 मिमी बायोप्सी पंच (Miltex, यॉर्क, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए पंच छेद एक ड्रिल प्रेस पर मुहिम शुरू की. किसी भी मलबे से बाहर खींचो.
- स्टांप की सुविधाओं के पक्ष और एक ऑक्सीजन प्लाज्मा नक़्क़ाश में 8 मिनट के लिए एक साफ गिलास ऑक्सीजन प्लाज्मा स्लाइड विषय. संपर्क में इलाज सतहों तुरंत लाने के लिए उन दोनों के बीच एक बांड फार्म. कम से कम 5 घंटे के लिए एक गर्म स्लाइड पर 60 डिग्री सेल्सियस पर विधानसभा रखेंएस बंधन को मजबूत करने के लिए.
- Inlets और दुकानों पुरुष luer ताला की एक इंटरफ़ेस connectors कांटेदार महिला luer ताला connectors (Qosina, Edgewood, NY) जुड़ी का उपयोग करने के लिए 0.032 "आईडी PTFE ट्यूबिंग (कोल परमार, Vernon हिल्स, आईएल) कनेक्ट.
- प्रवाह बंद वाल्व और Y संबंधक (चित्रा 1 Upchurch वैज्ञानिक, ओक हार्बर WA) का उपयोग करते हुए विधानसभा सेट. माइक्रोस्कोप डिवाइस माउंट. टयूबिंग 20G 1.5 "सुइयों (बायोसाइंस BD, रॉकविल, एमडी) का उपयोग करने के लिए सीरिंज देते.
2. वर्दी spheroids का गठन
Spheroids फांसी ड्रॉप 2,3 विधि द्वारा गठित किया गया.
- एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के नीचे कोशिकाओं Trypsinize.
- 2000 आरपीएम पर trypsinized कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 6 मिलीलीटर ताजा मध्यम में resuspend. शेयर एक वांछित अंतिम एकाग्रता (1 टेबल) समाधान पतला.
- एक 48 अच्छी तरह से थाली के कवर निकालें और Ste में उल्टा जगहहुड rilized. परिपत्र एक अच्छी तरह से इसी क्षेत्रों को कवर पर स्पष्ट कर रहे हैं. निष्फल पानी की 1 मिलीग्राम नमी बनाए रखने के साथ थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें. प्रत्येक परिपत्र क्षेत्र का उपयोग कर एक micropipette में पतला सेल समाधान के 20 μl छोटी बूंद रखो. ध्यान कवर पलटना और यह अच्छी तरह से थाली पर जगह है, यह सुनिश्चित करना है कि कुओं की बूँदें किनारों नहीं छूना.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर दिनों की एक निर्दिष्ट संख्या (1 टेबल) के लिए अच्छी तरह से थाली सेते हैं. एक उपगोल प्रत्येक हैंगिंग ड्रॉप में बनेगी.
3. Spheroids डिवाइस में परिचय
इस अनुभाग के लिए 1 और 2 टेबल चित्रा देखें.
- 70% प्रवाह इनलेट के माध्यम से शुरू की इथेनॉल के साथ निस्तब्धता द्वारा डिवाइस जीवाणुरहित. इसके बाद, फ्लश साथ PBS सेल संस्कृति मध्यम buffered HEPES द्वारा पीछा किया. मध्यम सिरिंज टयूबिंग जुड़ी एफ छोड़ दो.
- एस सिरिंज पी में 2-3 spheroids ड्रा, सिरिंज का दोहन करने के लिए हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, औरडिवाइस की पैकिंग इनलेट करने के लिए देते हैं.
- ओपन इनलेट वाल्व वी पिन और करीब वी फिन. ओपन आउटलेट वाल्व वी पोटा और करीब वी Fout. पैकिंग नीचे की ओर इशारा करते हुए सुई के साथ खड़ी सिरिंज पकड़ो, देखने के रूप में spheroids luer ताला संबंधक में सुई की सिरिंज के नीचे करने के लिए व्यवस्थित. पैकिंग सिरिंज और घड़ी spheroids पर सवार धक्का टयूबिंग और डिवाइस में प्रवाह दर्ज करें. क्योंकि केवल पैकिंग आउटलेट वाल्व खुला है, एक उपगोल डिवाइस के कक्ष में प्रवेश करने और वापस छवि (2) के पदों पर द्वारा बनाए रखा जाएगा.
- बंद इनलेट वाल्व वी पिन और आउटलेट वाल्व वी पोटा. एक सिरिंज पंप पर सिरिंज एस एफ माउंट. ओपन वाल्व वी फिन और वाल्व वी Fout. डिवाइस में 3 / μl मिनट पर फ्लो मध्यम.
4. Apoptosis का पता लगाने के एजेंट का परिचय (CaspGLOW)
Spheroids साथ कक्षों पैकिंग के बाद, यू के लिए संतुलन की अनुमति24 घंटे के लिए पी के लिए पोषक तत्व gradients और microenvironments apoptosis या चिकित्सीय एजेंट का पता लगाने शुरू करने से पहले स्थापित. क्योंकि कक्षों में ऊतकों ऊपर और नीचे से अभेद्य दीवारों के साथ संपर्क में हैं, वहाँ मोटाई के साथ कोई पोषक तत्व ऊतक (0.15mm) gradients हैं. ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, ऊतक की मोटाई के साथ सभी सेल परतें इसलिए बराबर कर रहे हैं और केवल एक दिशा में विजातिता प्रवाह चैनल से दूर है.
- वी फिन रहो, सिरिंज पंप बंद करो, पंप से सिरिंज एस एफ को हटाने और यह एक सिरिंज के साथ 0.25 μl / लाल CaspGLOW कस्पासे-3 मार्कर (लाल DEVD - FMK सक्रिय मिलीलीटर युक्त मध्यम होने की जगह, BioVision, माउंटेन व्यू, ) सीए.
- डिवाइस के माध्यम से मैन्युअल इस समाधान की 0.7 मिलीलीटर फ्लश बड़े माध्यम के विस्थापन को सुनिश्चित करने के. पर्वत पंप पर सिरिंज, प्रवाह पुनरारंभ करें, और खुले वी फिन. 5-8 घंटे की अवधि के दौरान, apoptosis टी में एजेंट diffuses का पता लगानेवह ऊतकों और apoptotic क्षेत्रों में उज्जवल fluoresces. Apoptosis इस एकाग्रता में एजेंट का पता लगाने डिवाइस में बाद के सभी प्रवाह समाधान में बनाए रखा है.
नोट:
- ऊतक विजातिता प्रतिदीप्ति रैखिक तीव्रता प्रोफाइल धारा 6 में वर्णित के रूप में प्राप्त करने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है. प्रोफाइल apoptosis में स्थानिक gradients दिखाने के लिए, पुष्टि है कि ऊतक सेल व्यवहार्यता के लिए सम्मान के साथ विषम चाहिए.
- CaspGLOW ग्रीन सक्रिय मार्कर कस्पासे 3 (Fluorescein DEVD - FMK, BioVision) को apoptosis का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मार्कर लाल fluorophore rhodamine की बजाय हरी fluorophore fluorescein शामिल हैं.
5. चिकित्सीय एजेंट का परिचय
- एजेंट का पता लगाने apoptosis युक्त; 4.1-4.2 कदम 10 सुक्ष्ममापी डॉक्सोरूबिसिन हाइड्रोक्लोराइड (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO Dox) शुरू में प्रक्रिया का पालन करें.
- Therape का प्रवाह जारीसमय की एक निश्चित अवधि के लिए utic एजेंट समाधान. वाल्व वी फिन रहो और सिरिंज पंप बंद. एक ताजा मध्यम एजेंट का पता लगाने apoptosis युक्त सिरिंज के साथ इलाज सिरिंज बदलें. 24 -36 घंटे के लिए ताजा माध्यम के प्रवाह की अनुमति जबकि लगातार एक खुर्दबीन के नीचे ऊतक निगरानी.
6. समय चूक और दवा diffusivity गुणांकों के माइक्रोस्कोपी आकलन
साफ प्रतिदीप्ति डेटा प्राप्त करने के लिए, ऊतकों के नीचे की परत पर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित करके सभी छवियों को प्राप्त करते हैं. क्योंकि वहाँ ऊर्ध्वाधर दिशा में कोई पोषक तत्व gradients (धारा 4 देखें) कर रहे हैं, कोशिकाओं की परतों के नीचे अन्य सभी परतों के ऊपर अच्छे प्रतिनिधि हैं.
- पूरे अधिग्रहण की प्रक्रिया में एक स्वनिर्धारित स्क्रिप्ट IPLab (बायोसाईंस BD, रॉकविल, एमडी) का उपयोग कर स्वचालित किया गया था. 10x बढ़ाई पैक उपगोल हर 30 मिनट (छवि 3 ए) के प्रेषित प्रकाश और प्रतिदीप्ति छवियों मोल. Acquirई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति Dox की शुरूआत करने से पहले छवि. कक्ष (1000 सुक्ष्ममापी x 300 सुक्ष्ममापी) के बड़े आकार के लिए समायोजित करने के लिए, दो सटे छवियों और उन्हें एक साथ 4 टाइल हासिल.
- दवा diffusivity गुणांकों के गणितीय आकलन के लिए पहले कदम के लिए औसत Dox प्रतिदीप्ति रैखिक तीव्रता प्रोफाइल ImageJ का उपयोग उत्पन्न करने के लिए है. ब्याज की एक आयताकार क्षेत्र (आरओआई) कक्ष में ऊतकों को शामिल चुनें. प्लॉट कमांड का प्रयोग करने के लिए प्रवाह चैनल से दूरी के एक समारोह के रूप में औसत तीव्रता के एक प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए. अप करने के लिए 3 अलग अलग समय बिंदुओं के लिए दोहराएँ.
- Dox ऊतक से autofluorescence उपाय शुरू करने से पहले एक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त करते हैं. प्राप्त तीव्रता प्रोफाइल से औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता घटाएँ और इसी अधिकतम तीव्रता द्वारा प्रत्येक प्रोफ़ाइल के मानक के अनुसार प्राप्त करने के लिए
(X, t) (3 छविबी). - अगले कदम के लिए ट्यूमर ऊतक के भीतर Dox की प्रभावी प्रसार गुणांक डी का मूल्यांकन करने के लिए है. Dox प्रसार निम्नलिखित समीकरण 5 द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है
जहां ERFC पूरक त्रुटि समारोह है, एक्स चैनल से ऊतक में दूरी है, और टी Dox की शुरूआत (3 चित्र देखें) के बाद समय है. हर बार माना बिंदु पर निम्नलिखित योजना चलने का प्रयोग करें:- लगता है कि विकास के लिए एक मूल्य
- प्रत्येक स्थान पर एक्स समीकरण के दाईं ओर की गणना
- दोनों पक्षों के बीच चुकता त्रुटियों का योग (अवशिष्ट) की गणना
- डी को संशोधित करने के लिए अवशिष्ट कम से कम
- डी के औसत इष्टतम मान प्रत्येक समय बिंदु पर प्राप्त करने के लिए ऊतक में औसत Dox के प्रभावी प्रसार गुणांक का अनुमान है.
(X, t) (3 छविबी). 
7. प्रतिनिधि परिणाम:
<पी वर्ग = "jove_content"> microfluidic उपकरणों 1mm प्रदान की x 0.3mm x 0.15mm ऑप्टिकली से तीन आयामी ट्यूमर ऊतक के विकास के लिए सुलभ संस्कृति कक्षों. Multicellular ट्यूमर spheroids इन कक्षों में लाया गया और पीठ पर दो फिल्टर पदों से बनाए रखा गया है. हैंगिंग ड्रॉप विधि लगातार आकार और कई सेल लाइनों से आकार के spheroids के जल्दी गठन की अनुमति दी. Spheroids सफलतापूर्वक डिवाइस पर 3 दिन के लिए बड़े हो रहे थे. कक्षों में वृद्धि spheroids भीतर microenvironments की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संशोधन के साथ जुड़े थे. Apoptosis कोशिकाओं में कम प्रवाह चैनल और ऊतकों में उच्च गहरी निकटता में हुई. डिवाइस के लिए डॉक्सोरूबिसिन के ट्यूमर के ऊतक में प्रसार गुणांक का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 8.75 x 10 -7 2 सेमी एस -1 के प्राप्त मूल्य 9.1 के मूल्य के साथ सहमत x 10 -7 2 सेमी -1 पहले मानव स्तन कैंसर में 6 की सूचना दी.| सेल लाइन | आवश्यक सेल एकाग्रता | ऊष्मायन समय |
| LS174T | 300 कोशिकाओं / μL | 2-3 दिन |
| T47D | 750 कोशिकाओं / μL | 3-4 दिनों |
| एमडीए MB-231 | 150 कोशिकाओं / μL | 5-6 दिन |
हैंगिंग ड्रॉप spheroids के लिए पैरामीटर तालिका 1.
| भाग | विवरण |
| एस एफ | फ्लो सिरिंज |
| एस एंड पी | सिरिंज पैकिंग |
| वी फिन | प्रवाह Inlet वाल्व |
| वी पिन | पैकिंग Inlet वाल्व |
| वी Fout | प्रवाह आउटलेट वाल्व |
| वी पोटा | पैकिंग आउटलेट वाल्व |
तालिका 2. प्रवाह सेटअप में सीरिंज और वाल्व
चित्रा 1 के योजनाबद्ध प्रवाह सेटअप वी फिन और वी Fout: फ्लो Inlet और आउटलेट वाल्व, वि पिन और वी पोटा: पैकिंग Inlet और आउटलेट वाल्व, एस एफ और पी एस: प्रवाह और पैकिंग सीरिंज. पैकिंग सिरिंज और Inlet और आउटलेट वाल्व पैकिंग जब एक उपगोल कक्ष में प्रवाहित किया जाता है. प्रवाह सिरिंज और प्रवाह Inlet और आउटलेट वाल्व मध्यम बाद में प्रवाह करने के लिए उपयोग किया जाता है.
चित्रा 2. एक डिवाइस पर एक कक्ष में फंस उपगोल के योजनाबद्ध एक उपगोल डिवाइस पर चैम्बर में प्रवाहित किया जाता है और दो फिल्टर स्थिति द्वारा अवरुद्धचैम्बर के पीछे टीएस.
चित्रा 3. डिवाइस पर ट्यूमर ऊतक में डॉक्सोरूबिसिन प्रसार. ए प्रेषित प्रकाश और लाल ऊतक के फ्लोरोसेंट छवि विलय, स्थान और डॉक्सोरूबिसिन (लाल) की एकाग्रता दिखा. पैमाने बार 250 सुक्ष्ममापी बी सामान्यीकृत डॉक्सोरूबिसिन प्रतिदीप्ति से रैखिक तीव्रता प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
ट्यूमर में vasculature विरल है और बीमार 7,8 विकसित. वहाँ तक रक्त वाहिकाओं है कि पोषक तत्वों और दवाओं हालांकि vasculature 9 आपूर्ति के लिए दुर्गम हैं से (> 100 सुक्ष्ममापी) क्षेत्रों स्थित हैं. परिणामस्वरूप विषम microenvironment के कई chemotherapeutics 10 सीमित प्रभावकारिता के लिए योगदान देता है. microfluidic डिवाइस विकसित एक विषम ट्यूमर microenvironment proliferating, इन विट्रो में मौन और apoptotic या परिगलित कोशिकाओं द्वारा विशेषता recreates. चैनल की निकटता में कोशिकाओं व्यवहार्य हैं, लेकिन प्रसार सीमाओं चैनल से दूर पोषण की कमी apoptotic क्षेत्रों को जन्म दे. प्रवाह चैनल एक रक्त वाहिका का प्रतिनिधित्व करता है और उपगोल एक रक्त वाहिका निकट ट्यूमर के भीतर एक छोटे से क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है.
जबकि डिवाइस में spheroids शुरू सुनिश्चित करने के लिए, कि छिद्रित इनलेट छेद स्वच्छ और मलबे से मुक्त है, क्योंकि किसी भी रुकावट के लिए ऊतक के प्रवाह के लिएविफलता में परिणाम के लिए चैम्बर, या एक टूटी हुई उपगोल भरना होगा. पैकिंग सिरिंज स्वयं spheroids शुरू करने की प्रक्रिया के दौरान संचालित है. प्रवाह दर संभव के रूप में कम के रूप में बनाए रखा जाना चाहिए चैम्बर के पीछे पदों के माध्यम से उपगोल धकेलने से बचने. सभी microfluidic उपकरणों के साथ के रूप में, कुछ उपाय करने के लिए प्रणाली में बुलबुले से बचने के लिए, खासकर जब सीरिंज स्विचन लिया जाना चाहिए. काटना टयूबिंग का एक छोटा सा टुकड़ा हर बार एक सिरिंज बंद है बुलबुले से बचने में मदद मिलेगी.
डिवाइस के लिए संशोधन करने के लिए एक ही प्रयोग में कई और कक्षों कई उपचार के उपयोग की अनुमति चल रहे हैं. हम मानते हैं कि इन उपकरणों के लिए वर्तमान ठोस ट्यूमर में कैंसर चिकित्सा के व्यवहार को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उन्होंने यह भी आसान के रूप में दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों का निर्माण करने के लिए नए कैंसर के उपचारों के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थान # 1R01CA120825-01A1, सहयोगात्मक बायोमेडिकल (सीबीआर) एमहर्स्ट मैसाचुसेट्स विश्वविद्यालय में रिसर्च प्रोग्राम, और भूषण जे Toley लिए Isenberg छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया. हम कृतज्ञता जेम्स Schafer, videographer, बयान, और इस वीडियो के संपादक के बहुमूल्य योगदान को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
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