Summary
Vi presenterar förfarandet för tillverkning och drift av en mikroflödessystem enhet som återskapar heterogena tumör mikromiljöer
Abstract
Vi har utvecklat en mikroflödessystem enhet som efterliknar leverans och systemisk clearance av läkemedel till heterogena tredimensionella tumörvävnader in vitro. Näringsämnen levereras av kärl inte når alla delar av tumörer, vilket ger upphov till heterogena mikromiljöer som består av livskraftiga, vilande och nekrotiska celltyper. Många cancerläkemedel misslyckas att effektivt penetrera och behandla alla typer av celler på grund av denna heterogenitet. Monoskikt av cancerceller inte härma inte denna heterogenitet, vilket gör det svårt att testa cancerläkemedel med en lämplig in vitro-modell. Vår mikrofluidikanordningar tillverkades av PDMS med mjuk litografi. Flercelliga tumör sfäroider, som bildas av hängande droppe metoden, infördes och begränsad till rektangulära kammare på enheten och underhållas med kontinuerlig medieperfusionshastighet på ena sidan. Den rektangulära formen av kamrar på enheten skapade linjära gradienter inom vävnaden. Fluorescerande fläckar användes för att kvantifiera ee variabilitet i apoptos inom vävnaden. Tumörer på enheten behandlades med den fluorescerande kemoterapeutiska läkemedlet doxorubicin, tidsförlopp mikroskopi användes för att övervaka dess diffusion in vävnad, och den effektiva diffusionskoefficienten uppskattades. Den hängande droppe Metoden innebar snabb bildning av enhetliga sfäroider från flera cancercellinjer. Enheten aktiveras tillväxten av sfäroider upp till 3 dagar. Celler i närheten av strömmande medium var minimalt apoptotisk och de långt från kanalen var mer apoptotiska därmed exakt härma regioner i tumörer intill blodkärl. Det uppskattade värdet av doxorubicin diffusionskoefficienten överens med en tidigare redovisade värdet i human bröstcancer. Eftersom inträngning och upptagning av läkemedel i solida tumörer påverkar deras effektivitet, anser vi att denna enhet är ett viktigt verktyg för att förstå beteendet av droger, och utveckla nya cancerfall läkemedel.
Protocol
1. Komponentframställning
Replikation av mikroflödessystem funktioner i elastomera material baserades på metoden beskriven av Duffy et al. 1
- Blanda elastomer (polydimetylsiloxan, PDMS) och härdare från silikonelastomeren Kit (Dow Corning, Midland, MI) i ett 9:1 viktförhållande och häll över befälhavaren att bilda en 4 mm tjockt skikt. Degas att avlägsna luftbubblor och härda blandningen vid 60 ° C under 5 timmar. Skala botade PDMS från formen för att få en stämpel flöde funktioner på elastomeren.
- Stanshål för inlopp och utlopp med en 1,5 mm biopsistans (Miltex, York, PA) monterad på en pelarborrmaskin. Dra ut eventuellt skräp.
- Utsätta funktioner sidan av stämpeln och en ren glasskiva till syre plasma under 8 minuter i en syre plasma etsare. Ta de behandlade ytorna i kontakt omedelbart att bilda en bindning mellan dem. Bibehåll aggregatet vid 60 ° C på ett objektglas varmare minst 5 timmars för att stärka banden.
- Anslut 0,032 "ID PTFE slang (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) till inlopp och utlopp med ett gränssnitt av manliga luerlock kontaktdon fäst hullingförsedda hona luer lock-kontakter (Qosina, Edgewood, NY).
- Ställ upp flödet montering med avstängningsventiler och en Y-koppling (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, figur 1). Montera enheten på mikroskopet. Fäst sprutor till slangen med 20G 1,5 "nålar (BD Bioscience, Rockville, MD).
2. Bildning av enhetliga sfäroider
Sfäroider bildades genom hängande droppe metoden 2,3.
- Trypsinisera cellerna under en steril cellodling huven.
- Centrifugera trypsinerade celler vid 2000 rpm under 5 minuter och återsuspendera i 6 ml färskt medium. Späd stamlösningen till en önskad slutlig koncentration (tabell 1).
- Ta bort locket på en 48 brunnars platta och placera den upp och ner i sterilized huva. Cirkulära regioner motsvarande varje brunn är uppenbara på omslaget. Fyll varje brunn av plattan med 1 ml steriliserat vatten för att bibehålla fuktigheten. Sätt en 20 pl droppe av den utspädda cellösningen i varje cirkulärt område med en mikropipett. Försiktigt invertera locket och placera den över brunnar, se till att dropparna inte vidrör kanterna på brunnarna.
- Inkubera plattan väl vid 37 ° C under ett angivet antal dagar (tabell 1). En sfäroid bildas i varje hängande droppe.
3. Införande av sfäroider i enhet
Se Figur 1 och Tabell 2 för detta avsnitt.
- Sterilisera anordningen genom spolning med 70% etanol införs genom flödesinloppet. Därefter, spola med PBS följt av HEPES-buffrade cellodlingsmedium. Låt mediet spruta S F ansluten till slangen.
- Rita 2-3 sfäroider i sprutan S P trycker sprutan för att avlägsna luftbubblor ochfäster packningen inlopp hos anordningen.
- Öppna inloppsventilen V Stift och nära V-Fin. Öppna utloppsventilen V Pout och nära V-Fut. Håll förpackningen sprutan vertikalt med nålen pekande nedåt, titta på sfäroider sjunka till botten av sprutan i luer lås kopplingen av nålen. Tryck in kolven på förpackningen sprutan och sfäroider titta in i slangen och flödet i enheten. Eftersom endast packningen utloppsventilen är öppen, kommer en sfäroid in i kammaren på enheten och behållas av inlägg på baksidan (bild 2).
- Stäng inloppsventilen V Stift och utloppsventil V Pout. Montera sprutan S F på en sprutpump. Öppna ventil V Fin och ventil V Fut. Flödesmedium in i anordningen vid 3 pl / min.
4. Införande av apoptos detektionsmedel (CaspGLOW)
Efter packning kammare med sfäroider, tillåta ekvilibrering för up till 24 timmar för att fastställa näringsämnen gradienter och mikromiljöer, innan införandet apoptos upptäcka eller terapeutiska medel. Eftersom vävnaderna i kamrarna är i kontakt med ogenomträngliga väggar från topp och botten finns det inga näringsämnen gradienter längs tjocklek (0,15 mm) i vävnaden. Efter 24 timmars inkubation, alla cellskikt längs tjockleken av vävnaden är därför ekvivalent och den enda heterogenitet är i en riktning bort från flödeskanalen.
- Stäng av V Fin, stanna sprutpumpen, ta bort sprutan S F från pumpen och ersätta den med en spruta som har medium innehållande 0,25 ul / ml CaspGLOW Röd Aktiv kaspas-3 markör (Red-DEVD-FMK, BioVision, Mountain View, CA).
- Manuellt spola 0,7 ml av denna lösning genom enheten för att säkerställa förflyttning av äldre medium. Montera sprutan på pumpen, starta flöde och öppna V-Fin. Under en period av 5-8 timmar, den apoptos detektering medlet diffunderar in than vävnad och fluorescerar ljusare i apoptotiska områden. Apoptos upptäcka ämne vid denna koncentration bibehålls i alla efterföljande flödeslösningar i enheten.
Notera:
- Vävnad heterogenitet kan bekräftas genom att erhålla linjära intensitetsprofiler av fluorescens som beskrivs i avsnitt 6. Profilerna ska visa rumsliga gradienter i apoptos, vilket bekräftar att vävnaden är heterogen med avseende på cellviabilitet.
- CaspGLOW Grön aktiv caspas-3 markör (fluorescein-DEVD-FMK, BioVision) kan också användas för att detektera apoptos. Denna markör innehåller den gröna fluoroforen fluorescein i stället för den röda fluoroforen rodamin.
5. Införande av terapeutiskt medel
- Följ proceduren i steg 4,1-4,2 för att införa 10 hydroklorid M doxorubicin (Dox, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) som innehåller apoptos upptäcka medel.
- Fortsätta flöde av therapeutic agent lösning för en bestämd tid. Avstängningsventil V Fin och stäng av sprutpumpen. Byt behandlingen sprutan med en färskt medium spruta innehållande apoptos upptäcka medel. Tillåta flöde av färskt medium under 24 -36 timmar under kontinuerlig övervakning av vävnaden under ett mikroskop.
6. Time-lapse Mikroskopi och Uppskattning av koefficienter Drug diffusivitet
För att erhålla renaste fluorescensdata, förvärva samtliga bilder genom att fokusera mikroskopet på botten lager av vävnad. Eftersom det inte finns några näringsämnen gradienter i vertikal riktning (se avsnitt 4), de nedersta skikten av celler är goda representanter för alla andra lager ovan.
- Hela förvärvsprocessen automatiserades med hjälp av en anpassad skript i IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Förvärva genomlysning och fluorescens bilder av den packade sfäroiden vid 10x förstoring var 30 minuter (fig. 3A). Förväre en bild av bakgrundsfluorescens före införandet av Dox. För att rymma för den stora storleken av kammaren (1000 ^ m x 300 | im), förvärvar två angränsande bilder och kakel ihop dem 4.
- För matematisk beräkning av koefficienter läkemedel diffusivitet, är det första steget att generera medelvärdesbildade linjära intensitetsprofiler av Dox fluorescens med ImageJ. Välj ett rektangulärt område av intresse (ROI) som omfattar vävnaden i kammaren. Använd kommandot Rita profil för att generera en profil av genomsnittliga intensitet som en funktion av avståndet från flödeskanalen. Upprepa för upp till 3 olika tidpunkter.
- Skaffa en bakgrundsfluorescens bild innan man inför Dox att mäta autofluorescens från vävnaden. Subtrahera den genomsnittliga intensiteten bakgrundsfluorescens från de erhållna intensitet profilerna och normalisera varje profil med motsvarande högsta stödnivå för att få
(X, t) (fig 3B). - Nästa steg är att utvärdera det faktiska D diffusionskoefficient Dox inom tumörvävnad. Dox diffusion kan representeras av följande ekvation 5
där erfc är den komplementära felfunktionen, är x avståndet in i vävnaden från kanalen, och t är tiden efter införande av Dox (se fig. 3). Använd följande iterativa schema vid varje vara tidpunkt:- Gissa ett värde för D
- Beräkna högra sidan av ekvationen vid varje position X
- Beräkna summan av kvadrerade fel (kvarvarande) mellan de två sidorna
- Ändra D för att minimera den kvarvarande
- Genomsnittliga de optimala värdena på D som erhållits vid varje tidpunkt för att uppskatta den genomsnittliga effektiva diffusionskoefficienten för Dox i vävnaden.
(X, t) (fig 3B). 
7. Representativa resultat:
<p class = "jove_content"> De mikroflödessystem enheter som 1mm X 0,3 X 0,15 optiskt tillgängliga kultur kammare för tillväxt av tredimensionella tumörvävnad. Flercelliga tumör sfäroiderna flögs in i dessa kamrar och var kvar av två filter inlägg på baksidan. Den hängande släpp-metoden tillåten snabb bildning av sfäroider av konsekvent storlek och form från flera cellinjer. Sfäroiderna framgångsrikt vuxit på enheten i upp till 3 dagar. Tillväxten i kamrarna var förknippad med en reproducerbar modifiering av mikromiljöer inom sfäroider. Apoptos inträffade mindre i celler i närheten av flödeskanalen och högre djupare in i vävnaden. Anordningen användes för att uppskatta diffusionskoefficienten av doxorubicin i tumörvävnad. Det erhållna värdet på 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 överensstämmer med värdet 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 tidigare rapporterat 6 i human bröstcancer.| Cell Line | Krävs cellkoncentration | Inkubation Tid |
| LS174T | 300 celler / | il | 2-3 dagar |
| T47D | 750 celler / | il | 3-4 dagar |
| MDA-MB-231 | 150 celler / | il | 5-6 dagar |
Tabell 1. Parametrar för hängande droppe sfäroider
| Del | Beskrivning |
| S F | Flöde Spruta |
| S P | Förpackning spruta |
| V Fin | Flöde Inloppsventil |
| V Stift | Packning Inloppsventil |
| V Fut | Flöde utloppsventil |
| V Pout | Packning utloppsventil |
Tabell 2. Sprutor och ventiler i Flow Setup
Figur 1 Schematisk av flödet inställningar V Fin och V Fut:. Flöde inlopps-och utloppsventiler, V Stift och V Pout: Packning inlopps-och utloppsventiler, S F och S P: Flow och förpackning sprutor. Packningen spruta och förpackning inlopps-och utloppsventiler används när en sfäroid flygs in i kammaren. Flödet spruta och flöde inlopps-och utloppsventiler används för att strömma mediet därefter.
Figur 2. Schematisk bild av en sfäroid instängd i en kammare på enheten. En sfäroid strömmar in i kammaren på enheten och blockeras av två filter posts på baksidan av kammaren.
Figur 3. Doxorubicin diffusion i tumörvävnad på enheten. A. Sammanfogade ljus och röda fluorescerande bild av vävnad, som visar placering och koncentration av doxorubicin (i rött). Skala stapel betecknar 250 | im. B. normaliserad linjär intensitetsprofil från doxorubicin fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kärlsystemet i tumörer är gles och dåligt utvecklade 7,8. Det finns regioner belägna långt (> 100 nm) från blodkärlen som är otillgängliga för näringsämnen och läkemedel levereras dock kärlsystemet 9. Den resulterande heterogena mikroomgivning bidrar till den begränsade effekten av många kemoterapeutiska 10. Den mikrofluidikanordning utvecklats här återskapar en heterogen tumör mikromiljö kännetecknad av prolifererande, vilande och apoptotiska eller nekrotiska celler, in vitro. Celler i närheten av kanalen är livskraftiga, men diffusionsbegränsningar ger upphov till näringsmässigt bristfälliga apoptotiska områden långt från kanalen. Flödeskanalen representerar ett blodkärl och sfäroiden utgör en liten region inom en tumör intill ett blodkärl.
Samtidigt införs sfäroider i enheten, se till att den stansade inloppshål är rent och fritt från skräp, eftersom varje hinder att flöda av vävnadkommer att resultera i ett misslyckande att fylla kammaren, eller en trasig sfäroid. Packningen sprutan manövreras manuellt under processen att införa sfäroider. Flödet måste hållas så låg som möjligt för att undvika att trycka sfäroid genom stolparna på baksidan av kammaren. Som med alla mikroflödessystem enheter, måste vissa åtgärder vidtas för att undvika bubblor i systemet, speciellt när man byter sprutor. Skära av en liten bit av slang varje gång en spruta slås bidrar till att undvika bubblor.
Ändringar av enheten för att tillåta användning av flera kamrar och flera behandlingar i ett enda experiment pågår. Vi tror att dessa enheter kan användas för att förstå beteendet hos de nuvarande cancer läkemedel i solida tumörer. De kan också användas som lätt att konstruera läkemedel-screening plattformarna för att utveckla nya cancerbehandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag # 1R01CA120825-01A1, Collaborative Biomedical Research (CBR) Program vid University of Massachusetts Amherst och Isenberg Stipendium för Bhushan J. Toley. Vi tackar det värdefulla bidraget från James Schafer, den videographer, berättare, och redaktör för den här videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
