La stimolazione meccanica delle cellule staminali Utilizzando ciclica deformazione uniassiale
Summary
E 'ampiamente compreso che le forze meccaniche nel corpo può influenzare la differenziazione e proliferazione cellulare. Qui vi presentiamo un protocollo di video che illustra l'uso di una custom-built bioreattore per la distribuzione di tensione uniassiale di trazione ciclica alle cellule staminali coltivate su substrati flessibili micropatterned.
Abstract
Il ruolo delle forze meccaniche per lo sviluppo e il mantenimento dei tessuti biologici è ben documentata, tra cui diversi fenomeni meccanicamente regolamentati quali il rimodellamento osseo, ipertrofia muscolare e plasticità delle cellule muscolari lisce. Tuttavia, le forze in gioco sono spesso estremamente complessi e difficili da monitorare e controllare in vivo. Per meglio studiare gli effetti di forze meccaniche sulle cellule, abbiamo sviluppato un metodo in vitro per l'applicazione di tensione uniassiale di trazione ciclica di cellule aderenti coltivati su membrane elastiche. Questo metodo utilizza un design personalizzato bioreattore con un cam-rotore sistema motorizzato di applicare la forza desiderata. Qui vi presentiamo uno step-by-step protocollo video che dimostrano come assemblare i vari componenti di ogni "camera stretch", tra cui, in questo caso, una membrana di silicone con topografia micropatterned di orientare le cellule con la direzione del ceppo. Abbiamo anche descrivere le procedure per la sterilizzazione delle camere, semina sulla membrana delle cellule, la camera di blocco nel bioreattore, e regolando i parametri meccanici (per esempio grandezza e la velocità di deformazione). Le procedure descritte in questo particolare protocollo sono specifici per la semina cellule staminali mesenchimali su membrane di silicone con 10 canali micron gamma orientati parallelamente alla direzione di deformazione. Tuttavia, i metodi e materiali presentati in questo sistema sono abbastanza flessibili per accogliere una serie di variazioni su questo tema: velocità di deformazione, grandezza, durata, tipo di cellula, topografia membrana, membrana di rivestimento, ecc possono essere personalizzati per l'applicazione desiderata o esito. Questo è un metodo affidabile per lo studio degli effetti di deformazione a trazione uniassiale applicata alle cellule in vitro.
Protocol
Discussion
Banes et al. prima riportato l'uso di un sistema di stimolazione meccanica delle cellule in vitro, utilizzando un substrato flessibile elastomerico per fornire forza meccanica alle cellule 1. Da allora, molte varianti di questo disegno sono stati concepiti e utilizzati. Diversi sistemi meccanici tratto sono disponibili in commercio sotto il nome "Flexercell" (Flexcell International Corp.), mentre alcuni laboratori utilizzano custom-built dispositivi. In questo protocollo video che abbiamo descritto la configurazione…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungizone | Reagent | Lonza | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | Gibco | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | Gibco | 11966-025 |
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
