Summary
E 'ampiamente compreso che le forze meccaniche nel corpo può influenzare la differenziazione e proliferazione cellulare. Qui vi presentiamo un protocollo di video che illustra l'uso di una custom-built bioreattore per la distribuzione di tensione uniassiale di trazione ciclica alle cellule staminali coltivate su substrati flessibili micropatterned.
Abstract
Il ruolo delle forze meccaniche per lo sviluppo e il mantenimento dei tessuti biologici è ben documentata, tra cui diversi fenomeni meccanicamente regolamentati quali il rimodellamento osseo, ipertrofia muscolare e plasticità delle cellule muscolari lisce. Tuttavia, le forze in gioco sono spesso estremamente complessi e difficili da monitorare e controllare in vivo. Per meglio studiare gli effetti di forze meccaniche sulle cellule, abbiamo sviluppato un metodo in vitro per l'applicazione di tensione uniassiale di trazione ciclica di cellule aderenti coltivati su membrane elastiche. Questo metodo utilizza un design personalizzato bioreattore con un cam-rotore sistema motorizzato di applicare la forza desiderata. Qui vi presentiamo uno step-by-step protocollo video che dimostrano come assemblare i vari componenti di ogni "camera stretch", tra cui, in questo caso, una membrana di silicone con topografia micropatterned di orientare le cellule con la direzione del ceppo. Abbiamo anche descrivere le procedure per la sterilizzazione delle camere, semina sulla membrana delle cellule, la camera di blocco nel bioreattore, e regolando i parametri meccanici (per esempio grandezza e la velocità di deformazione). Le procedure descritte in questo particolare protocollo sono specifici per la semina cellule staminali mesenchimali su membrane di silicone con 10 canali micron gamma orientati parallelamente alla direzione di deformazione. Tuttavia, i metodi e materiali presentati in questo sistema sono abbastanza flessibili per accogliere una serie di variazioni su questo tema: velocità di deformazione, grandezza, durata, tipo di cellula, topografia membrana, membrana di rivestimento, ecc possono essere personalizzati per l'applicazione desiderata o esito. Questo è un metodo affidabile per lo studio degli effetti di deformazione a trazione uniassiale applicata alle cellule in vitro.
Protocol
Giorno 0 - Sterilizzazione prima della data di esperimento
- Mettere i materiali in vasca di plastica e sterilizzare con alcool al 70% per 2 ore:
- Chambers
- Coperchi
- Cornici (tutti e 3 pezzi)
- Viti
- Guarnizioni in gomma
- Forcipe
- Forbici
- Hex chiavi
- Membrane Aquet Pulire con sapone e acqua distillata.
- Sonicare membrane in alcool al 70% per 10 minuti.
- Posizionare le membrane pulite nella plastica piatti quadrati. Se si utilizza membrane fantasia, in modo che il lato modellato è rivolto verso l'alto (alcool vaporizzare su un lato della membrana e guardare per il liquido a correre giù per i solchi).
- Lascia membrane coperto di alcool al 70% per 2 ore.
- Guanti pacchetto in un foglio di alluminio per la sterilizzazione in autoclave domani mattina.
- Fai 2% (peso / volume) soluzione di gelatina (2g/100mL) in acqua distillata per sterilizzazione in autoclave domani.
- Dopo la sterilizzazione 2 ore nel 70% di alcol, luogo tutti i materiali polimerici e membrane (non autoclavabile materiali) in cappuccio UV per una notte:
- Chambers
- Coperchi
- Cornici (tutti e 3 pezzi)
- Membrane
- Confezione di materiali rimanenti in borsa autoclavabile:
- Viti
- Guarnizioni in gomma
- Forcipe
- Forbici
- Hex chiavi
Giorno 1 - Assemblea delle Camere tratto
- Autoclave pinze, forbici, chiavi esagonali, viti, guarnizioni, guanti, e gelatina con autoclave piccoli a 240 ° C per 20 minuti totali
- Rimuovere le membrane da raggi UV e trattare con O 2 al plasma (lato fantasia verso l'alto) per ~ 1 minuto.
- Nel cofano TC, coprono un'area modellata su membrane plasmatiche trattate con gelatina. Cappotto 30 per minuti sotto UV.
- Lavare ogni membrana con PBS 2X. Dopo il lavaggio 2 °, lasciare un po 'PBS sulle membrane per tenerli scivoloso, per facilitare il montaggio nelle camere. (Se anche utilizzare questa PBS per lubrificare le guarnizioni per facilitare il montaggio).
- Montare le membrane in camere (indossare guanti sterilizzati in autoclave in fase di montaggio)
- Collegare i due pezzi principali del telaio con una sola vite.
- Capovolgere il telaio su una membrana e posto sulla parte superiore in modo che la gelatina rivestite facce laterali verso il telaio (l'area modellata dovrebbe essere al centro).
- Fissare la membrana al telaio tramite una guarnizione per ogni lato.
- Premere il guarnizioni, con dolce, anche la pressione, per non strappare la membrana.
- Fissare telaio assemblato a T-bar.
- Capovolgere il telaio e posto in camera a testa in giù. UV retro del telaio e della membrana per 30 minuti
- Capovolgere il telaio nuovo, e vite in camere (nessun cambiamento per camera di controllo, ma per il tratto da camera, necessità di utilizzare due viti per fissare il pezzo finale del telaio per il fondo della camera, e la necessità di rimuovere la vite che è tenendo i due pezzi del telaio insieme). Laterali anteriori UV per 30 min. Assicurarsi che le membrane sono completamente asciutti prima di procedere alla fase successiva, oppure la soluzione cella può scivolare durante la semina.
- Semi di cellule. Superficie di 1 = Area piastra di 3 membrane, in modo da usare 1 / 3 di un piatto confluenti per membrana. Usare 1 ml di soluzione per cella a membrana. Non più di 1,5 ml sarà difficile tenere soluzione su. Mettere soluzione cellula solo su un'area modellata, e usare la punta della pipetta per diffondere la soluzione in giro. Coprire e lasciare che le cellule camere di attaccare per 30 minuti RT nel cappuccio.
- Spostare camere di un'incubatrice e lasciare che le cellule allegare per 1 ora di più. Essere molto attenti in movimento le camere per evitare di lasciare soluzione cellula scivolare! Le cellule in quella camera si rovina se la soluzione cade a questo punto.
- Ritorna alla camera di cappuccio e aggiungere 20 ml multimediali.
- Camere posto in alcool-pulito vasca che è coperto con un foglio di alluminio (anche spruzzato con l'alcol). Spostare camere per allungare incubatore (10% di CO 2).
- Camere di sicuro in macchina stretch. Lasciate che altre cellule allegare tutta la notte, e iniziare a allungare il giorno successivo. (Nota: quando mettono camere in macchina tratto, ricordarsi di bloccare la macchina in posizione "zero" prima di piazzare le camere, e quindi stringere l'elastico intorno al ingranaggi Non dimenticare di sbloccare gli ingranaggi prima di avviare la macchina.).
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Discussion
Banes et al. prima riportato l'uso di un sistema di stimolazione meccanica delle cellule in vitro, utilizzando un substrato flessibile elastomerico per fornire forza meccanica alle cellule 1. Da allora, molte varianti di questo disegno sono stati concepiti e utilizzati. Diversi sistemi meccanici tratto sono disponibili in commercio sotto il nome "Flexercell" (Flexcell International Corp.), mentre alcuni laboratori utilizzano custom-built dispositivi. In questo protocollo video che abbiamo descritto la configurazione e l'utilizzo di uno di questi dispositivi nel nostro laboratorio.
Il custom-built "macchina stretch" rappresentato in questo protocollo è stato utilizzato in vari studi per studiare gli effetti di tensione ciclica uniassiale su diversi tipi di cellule 2,3. Questa macchina è un apparecchio versatile, con diversi parametri regolabili che possono essere utilizzati per una varietà di studi sollecitazioni meccaniche. La configurazione indicati nel presente accordo rappresenta un metodo unico e robusto per la consegna di tensione uniassiale ciclico di cellule aderenti nella coltura.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
