Summary
É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.
Abstract
O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada "câmara de estiramento", incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.
Protocol
Dia 0 - Esterilização antes do dia de experimento
- Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas:
- Chambers
- Tampas
- Quadros (todos os 3 peças)
- Parafusos
- Juntas de borracha
- Fórceps
- Tesoura
- Chaves Hex
- Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada.
- Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos.
- Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrados. Se utilizando membranas padronizada, garantir que o lado padronizada é a face para cima (álcool de spray em um lado da membrana e prestar atenção para o líquido para executar as ranhuras).
- Deixe membranas cobertas em álcool 70% por 2 horas.
- Luvas de pacote em folha de alumínio para autoclave amanhã de manhã.
- Faça 2% (peso / volume) de solução de gelatina (2g/100mL) em água destilada para autoclave amanhã.
- Após a esterilização duas horas em álcool 70%, coloque todos os materiais de polímeros e membranas (não autoclavável materiais) na capa de UV durante a noite:
- Chambers
- Tampas
- Quadros (todos os 3 peças)
- Membranas
- Pacote de materiais remanescentes na bolsa autoclavável:
- Parafusos
- Juntas de borracha
- Fórceps
- Tesoura
- Chaves Hex
Dia 1 - Montagem das câmaras de estiramento
- Forceps autoclave, tesouras, chaves hex, parafusos, juntas, luvas, e gelatina utilizando autoclave pequena a 240 ° F durante 20 minutos no total
- Remova as membranas de UV e tratar com O 2 plasma (lado modelado para cima) para ~ 1 minuto.
- TC na capa, capa área padronizada de membranas de plasma tratado com gelatina. Casaco de 30 para minutos sob UV.
- Lavar cada membrana com PBS 2X. Após a lavagem 2, deixar alguns PBS nas membranas para mantê-los escorregadios, para facilitar a montagem para as câmaras. (Deve também usar este PBS para lubrificar as juntas para facilitar a montagem).
- Montar membranas em câmaras (usar luvas autoclavado durante a montagem)
- Ligar as duas principais peças do quadro usando um único parafuso.
- Virar o quadro e coloque uma membrana na parte superior de modo que as faces de gelatina revestido lateral em direção à estrutura (área padrão deve estar no centro).
- Assegurar a membrana para o quadro usando uma junta em cada lado.
- Pressione a juntas de, usando gentil, mesmo pressão, para não rasgar a membrana.
- Anexar quadro montado para T-bar.
- Virar o quadro e colocar em câmara de cabeça para baixo. Verso da moldura UV e membrana por 30 minutos
- Vire a moldura novamente, e parafuso em câmaras (sem mudança para câmara de controle, mas para câmara de estiramento, precisa usar dois parafusos para fixar a peça final do quadro para o fundo da câmara, e precisa remover o único parafuso que é segurando as duas peças do quadro juntos). Frente UV por 30 min. Certifique-se que as membranas estejam completamente secas antes de prosseguir para a próxima etapa, ou então a solução da célula pode escapar durante a semeadura.
- Células da semente. Área de 1 = Área da placa de 3 membranas, portanto, use 1 / 3 de uma placa confluentes por membrana. Use 1 mL de solução por célula de membrana. Mais do que 1,5 ml será difícil manter em solução. Coloque solução única célula na área de estampados, e usar a ponta da pipeta para espalhar a solução ao redor. Cubra e deixe câmaras anexar células por 30 minutos RT no capô.
- Mover câmaras para incubadora e vamos anexar células por mais 1 hora. Ter muito cuidado movendo as câmaras de evitar que solução da célula escorregar! As células em que câmara será arruinado se a solução cai neste momento.
- Retorno câmara para capô e adicionar 20 mL de mídia.
- Câmaras lugar em álcool limpo banheira que é coberto com folha de alumínio (também pulverizadas com álcool). Mover câmaras para esticar incubadora (10% CO 2).
- Câmaras de seguro para uma máquina de estiramento. Vamos anexar células mais durante a noite, e começar a esticar no dia seguinte. (Nota: quando colocar câmaras em máquina de esticar, lembre-se de bloquear a máquina na posição "zero" antes de colocar câmaras, e então aperte o elástico em volta das engrenagens Não se esqueça de desbloquear as engrenagens antes de iniciar a máquina.).
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Discussion
Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células 1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome "Flexercell" (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que descrevemos a configuração e uso de um dispositivo como esse em nosso laboratório.
A custom-built "máquina de esticar" descrita neste protocolo tem sido usado em vários estudos para investigar os efeitos da tensão cíclica uniaxial em diferentes tipos de células 2,3. Esta máquina é um aparelho versátil com diversos parâmetros ajustáveis que podem ser usados para uma variedade de estudos tensão mecânica. A configuração descrita aqui representa um método único e robusto para a entrega de tensão cíclica uniaxial para células aderentes em cultura.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
