É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.
Abstract
O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada "câmara de estiramento", incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.
Protocol
Dia 0 – Esterilização antes do dia de experimento Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas: Chambers Tampas Quadros (todos os 3 peças) Parafusos Juntas de borracha Fórceps Tesoura Chaves Hex Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada. Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos. Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrad…
Discussion
Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células 1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome "Flexercell" (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que de…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Fungizone
Reagent
Lonza
17-836R
aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C.
Kanamycin
Reagent
Gibco
15160-054
50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C.
Gentamicin
Reagent
Lonza
17-518Z
50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C.
Pen/Strep
Reagent
Gibco
15140-122
1% final. (Also available from other companies)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
Reagent
Gibco
11966-025
Notes on media:
These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells).