Dit protocol beschrijft een activiteit-gebaseerde test voor het opsporen van matrix metalloproteïnasen in kweeksupernatanten of lichaamsvloeistoffen.
Matrix (MMP's) zijn zink-bevattende endopeptidasen. Ze breken eiwitten door splitsing van peptidebindingen. Meer dan twintig MMP's zijn geïdentificeerd en worden gescheiden in zes groepen op basis van hun structuur en substraat specificiteit (collagenases, gelatinasen, membraan [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, en anderen). MMP's spelen een cruciale rol in cel invasie, afbraak van kraakbeen, weefsel remodelleren, wondgenezing, en embryogenese. Daartoe nemen zij deel in zowel de normale processen en in de pathogenese van vele ziekten, zoals reumatoïde artritis, kanker, of chronische obstructieve longziekte 1-6. Hier zullen we ons richten op MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), een breed uitgedrukt MMP. We zullen laten zien hoe u MMP-2 te detecteren in cel kweeksupernatanten door zymografie, een veel gebruikte, eenvoudige en toch zeer gevoelige techniek voor het eerst beschreven in 1980 door C. Heussen en EB Dowdle 7-10. Deze techniek is semi-kwantitatief, kan dus gebruikt worden om MMP niveaus in proefmonsters bepalen wanneer bekende concentraties van recombinant MMP worden geladen op dezelfde gel 11.
Oplossingen die MMPs (bijv. mobiele kweeksupernatanten, urine of serum) worden geladen op een polyacrylamide gel met natriumdodecylsulfaat (SDS, om de eiwitten lineariseren) en gelatine (substraat voor MMP-2). Het monster buffer is bedoeld om te proeven viscositeit te verhogen (tot gel laden te vergemakkelijken), een tracking kleurstof (broomfenolblauw, om te proeven migratie monitor) te bieden, om te voorzien denatureren moleculen (aan eiwitten lineariseren), en de controle van de pH van het monster. Eiwitten worden dan toegestaan om op grond van een elektrische stroom migreren in een actieve buffer ontworpen om een constante migratie tarief te bieden. De afstand van de migratie is omgekeerd gecorreleerd met het molecuulgewicht van het eiwit (kleine eiwitten bewegen sneller door de gel dan de grote eiwitten doen en daarom verder naar beneden de gel migreren). Na de migratie, wordt de gel in een renaturing buffer om eiwitten om hun tertiaire structuur, die noodzakelijk zijn voor enzymatische activiteit te herwinnen. De gel wordt dan geplaatst in een ontwikkelingsland buffer is ontworpen om de protease aan de ondergrond te verteren. De ontwikkelingslanden buffer bevat ook p-aminophenylmercuric acetaat (APMA) om de niet-proteolytische pro-MMP's te activeren in actieve MMPs. De volgende stap bestaat uit het kleuren van de ondergrond (gelatine in ons voorbeeld). Na het wassen de overtollige kleurstof uit de gel, de gebieden van protease spijsvertering verschijnen als duidelijk bands. Hoe duidelijker de band, hoe geconcentreerder de protease bevat. Band kleuringsintensiteit kan dan worden bepaald door densitometrie, met behulp van een software zoals ImageJ, waardoor sample vergelijking.
We hebben aangetoond hoe zymographic analyse van MMP-2 in cel kweeksupernatanten uit te voeren.
De hoeveelheid van het monster te laden op een gel moet worden bepaald empirisch afhankelijk van de herkomst en de MMP van belang. Het laden te weinig zal voorkomen dat detectie tijdens het laden te veel kan leiden tot een verzadiging als er maar zo veel substraat een protease kan verteren in het gebied van de band. Indien nodig, kan het monster worden verdund in gedeïoniseerd water vóór het mengen met het laden van buffer of het ontwikkelen van de tijd kan de verlaagd van 's nachts tot 4 uur. Het is ook mogelijk om eiwitten te concentreren in een oplossing met behulp van concentrators (bijv. Millipore catalogus # UFC803024). Als bands blijven nauwelijks zichtbaar zijn, kan het nodig zijn om de gels voor een langere tijd ontwikkelen, zelfs tot 48 uur. Bij de voorbereiding van monsters van weefsel kweeksupernatanten, dient te worden opgemerkt dat foetale runder serum (en andere sera) MMP's die invloed hebben op de resultaten bevat. Om deze reden, verzamelen we al onze supematanten na cultuur in serum-vrij medium.
Het wast beschreven in de paragrafen 2.9 en 2.10 van het protocol nodig zijn om de achtergrond kleuring van verteerde banden te verwijderen. Langere wastijden verwijdert meer achtergrond, maar zal ook dimmen de kleuring van de ondergrond in de gel. Als er langere tijd was nodig zijn, raden we het scannen van de gel om de paar uur om de scan te selecteren met de beste contrast.
Deze techniek kan gebruikt worden om andere MMP's op te sporen. Kan bijvoorbeeld MMP-9 worden gedetecteerd op gelatine gels, en ook in mindere mate MMP-1, MMP-8 en MMP-13 zoals gelatine is niet hun voorkeur substraat. MMP-1 en MMP-13 zijn het beste gedetecteerd op collageen zymografie terwijl caseïne is de beste substraat voor MMP-11 en maakt het ook mogelijk voor de detectie van MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 en MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) en collagenasen (MMP-1 en MMP-13) zijn moeilijk te detecteren wanneer deze zich op een laag niveau in caseïne of gelatine gels. Toevoeging van heparine aan de steekproef op het moment van het laden van gel verbetert de detectiegrens voor MMP-7. Voor MMP-1 en MMP-13, de heparine te worden toegevoegd aan de gel na het elektroforetisch run is al aan de gang 12.
Sinds zymografie maatregelen enzymatische activiteit na denaturatie en renaturatie van de enzymen, zal het meten van de activiteit van alle MMP's in het monster aanwezig. Deze enzymen, pro-enzymen, en enzymen gebonden aan endogene remmers (bijv. TIMP-2). Het is echter mogelijk om het niveau van MMP activering in de monster te bepalen door het vergelijken van de band dichtheid van het actieve enzym en van die van de pro-enzym, dat een iets hoger moleculair gewicht zal hebben.
Zymografie is vaak niet voldoende om een MMP te identificeren. Vergelijking van de migratie van een MMP met een bekend molecuulgewicht normen helpt bij de identificatie, maar dient te worden opgemerkt dat sommige van deze normen een reductiemiddel bevat en dat bij gebruik onder niet-reducerende voorwaarden zij zich kunnen wijzen op verschillende moleculaire gewichten 9. Een optie is om een oplosbare recombinant MMP belasting op dezelfde gel als de analysemonsters. MMPs kunnen echter in verband worden gebracht met andere eiwitten, het induceren van een verandering in de schijnbaar moleculair gewicht. Selectieve MMP-remmers kan worden toegevoegd aan de gel (of een deel van een gel gehalveerd) tijdens de incubatie in de ontwikkeling van buffer als farmacologische instrumenten om de identiteit van de MMP van interest.A tweede techniek (Western Blot, immunocytochemie, of ELISA) wordt aanbevolen om helpen bij de identificatie van de MMP van belang. Opgemerkt moet worden dat de detectielimieten voor de westerse Blots vaak veel lager dan die van zymographic gels, wat kan leiden tot fout-negatieve resultaten bij het gebruik van deze techniek.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Dr S. Ressler (Departement Moleculaire en Cellulaire Biologie, Baylor College of Medicine) bedanken voor het suggereren van het gebruik van eiwit concentrators om de concentratie van MMP's te verhogen in cel kweeksupernatanten.
Dit project werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en de NIH / NIAMS (AR059838) naar CB. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |