Detta protokoll beskriver en aktivitet-baserad analys för detektion av metalloproteinaser i kultur supernatanterna eller kroppsvätskor.
Metalloproteinaser (MMPs) är zink-innehållande endopeptidaser. De bryts ned proteiner genom klyvning av peptidbindningar. Mer än tjugo MMPs har identifierats och är uppdelade i sex grupper baserat på deras struktur och substrat specificitet (collagenases, gelatinases, membrantyp [MT-MMP] stromelysins, matrilysins och andra). MMPs spelar en avgörande roll i cell invasion, brosk nedbrytning, vävnad remodeling, sårläkning och fosterutveckling. De deltar därför i både normala processer och i patogenesen av många sjukdomar, såsom reumatoid artrit, cancer eller kronisk obstruktiv lungsjukdom 1-6. Här kommer vi att fokusera på MMP-2 (gelatinase A, typ IV kollagenas), ett allmänt uttryckt MMP. Vi kommer att visa hur man upptäcker MMP-2 i supernatanter cellodling av zymography, ett vanligt, enkelt, och ändå mycket känslig teknik som först beskrevs 1980 av C. Heussen och EB Dowdle 7-10. Denna teknik är semikvantitativ kan det därför användas för att bestämma MMP nivåer i proverna då kända koncentrationer av rekombinant MMP lastas på samma gel 11.
Lösningar som innehåller MMPs (t.ex. cellodling supernatanterna, urin eller serum) lastas på en polyakrylamidgel innehåller natriumdodecylsulfat (SDS, att linjärisera de proteiner) och gelatin (substrat för MMP-2). Provet bufferten är utformad för att öka prov viskositet (för att underlätta gel lastning), ger en spårning färgämne (Bromfenolblått, att övervaka prov migration), ger denatureringen molekyler (till linjärisera proteiner), och kontrollera pH-värdet i provet. Proteiner är då tillåtet att flytta under en elektrisk ström i en löpande buffert för att ge en konstant migration hastighet. Avståndet migration är omvänt korrelerad med molekylvikt av proteinet (små proteiner rör sig snabbare genom gelen än stora proteiner och därför vandrar längre ner gelen). Efter migreringen är gelen placeras i en renaturing buffert så att proteiner för att återvinna sin tertiära struktur som behövs för enzymatisk aktivitet. Gelen placeras sedan i ett u-buffert för att låta proteaset att smälta sitt substrat. Utvecklingsländerna bufferten innehåller också p-aminophenylmercuric acetat (APMA) för att aktivera den icke-proteolytiska pro-MMPs till aktiva MMPs. Nästa steg består av färgning av substrat (gelatin i vårt exempel). Efter tvättning av överflödig färg bort gel, områden proteas matsmältningen visas som tydligt band. Ju tydligare bandet, mer koncentrerad proteaset den innehåller. Band färgningsintensitet kan sedan bestämmas genom densitometri, med hjälp av ett program som ImageJ, vilket möjliggör prov jämförelse.
Vi har visat hur man utför zymographic analys av MMP-2 i supernatanter cellkultur.
Mängden prov till lasten på en gel måste bestämmas empiriskt beroende på ursprung och MMP av intresse. Laddar för lite kommer att förhindra upptäckt, läser för mycket kan leda till mättnad eftersom det bara finns så mycket substrat ett proteas kan smälta inom bandet. Vid behov kan provet spädas med avjoniserat vatten innan de blandas med buffert eller i utvecklingsländerna tid kan de minskat från natten till 4 timmar. Det är också möjligt att koncentrera proteiner i en lösning med koncentratorer (t.ex. Millipore katalog # UFC803024). Om banden fortfarande knappt synliga, kan det vara nödvändigt att utveckla geler under en längre tid, ända upp till 48 timmar. När man förbereder prover från supernatanter vävnadsodling, bör det noteras att fetalt bovinserum (och andra serum) innehåller MMPs som kan påverka resultaten. Av den anledningen samlar vi alla våra supernatanter efter kultur i serumfritt medium.
De tvättar som beskrivs i punkterna 2.9 och 2.10 i protokollet är nödvändigt att ta bort bakgrundsfärgning av smält band. Längre tvätta gånger kommer att ta bort mer bakgrund, men kommer också att dämpa färgning av substrat i hela gelen. Om längre tvätta tider är nödvändiga, rekommenderar vi att skanna gelen varannan timme för att välja skanna med den bästa kontrasten.
Denna teknik kan användas för att upptäcka andra MMPs. Till exempel kan MMP-9 kan upptäckas på gelatin geler, och även till en lägre grad MMP-1, MMP-8, och MMP-13 som gelatin är inte deras bästa substrat. MMP-1 och MMP-13 detekteras bäst på kollagen zymography medan kasein är att föredra substrat för MMP-11 och även gör det möjligt för detektion av MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 och MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) och collagenases (MMP-1 och MMP-13) är svåra att upptäcka när de förekommer i låga nivåer i kasein eller gelatin geler. Tillägg av heparin till provet vid tidpunkten för gel lastning förbättrar avsevärt detektionsgränsen för MMP-7. För MMP-1 och MMP-13, måste heparin läggas till gelen efter elektrofores köra pågår redan 12.
Eftersom zymography åtgärder enzymatisk aktivitet efter denaturering och Återställande av de enzymer, kommer det att mäta aktiviteten hos alla MMPs i provet. Detta omfattar enzymer, pro-enzymer, och enzymer bundna till endogen hämmare (t.ex. TIMP-2). Det är dock möjligt att bestämma nivån av MMP aktivering i provet genom att jämföra bandet tätheten av aktiva enzymet och av den för den pro-enzym, som kommer att ha en något högre molekylvikt.
Zymography är ofta inte tillräckligt för att identifiera en MMP. Jämförelse av migration en MMP med känd molekylvikt standarder hjälper till att identifiera, men det bör noteras att vissa av dessa standarder innehåller ett reduktionsmedel och som när de används under icke-reducerande förhållanden de kan visa på olika molekylvikt 9. Ett alternativ är att ladda ett lösligt rekombinant MMP på samma gel som proverna. MMPs kan dock vara förknippade med andra proteiner, förmå en förändring i uppenbar molekylvikt. Selektiva MMP-hämmare kan läggas till gelen (eller del av en gel halveras) under inkubationstiden för att utveckla buffert som farmakologiska verktyg för att identifiera de MMP av interest.A andra tekniken (Western Blot, immuncytokemi eller ELISA) rekommenderas att hjälp i identifieringen av MMP av intresse. Det bör noteras att detektionsgränserna för Western blotting ofta är mycket lägre än zymographic gel, vilket kan leda till falskt negativa resultat när man använder denna teknik.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr S. Ressler (Institutionen för molekylär och cellulär biologi, Baylor College of Medicine) för att föreslå användning av protein koncentratorer för att öka koncentrationen av MMPs i supernatanter cellkultur.
Projektet har finansierats med bidrag från Mrs Clifford Elder Vit Graham Begåvad forskningsfonden och NIH / NIAMS (AR059838) till CB. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |