Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Summary

Nanopartikel aus Indinavir, Ritonavir, Efavirenz und Atazanavir wurden unter Verwendung Nassmahlen, Homogenisierung und Ultraschall. Diese Nanoformulierungen, kollektiv als nanoformulated antiretroviralen Therapie (Nanoart), beurteilt Makrophagen-based Drug Delivery. Monozyten-Makrophagen-abgeleitete Nanoart Aufnahme, Speicherung und Freisetzung bestimmt. Diese vorläufigen Studien legen nahe, das Potenzial der Nanoart für den klinischen Einsatz.

Abstract

Nanoformulated Medikamente verbessern können Pharmakodynamik und Bioverfügbarkeit beim Dienen auch die Medikamente für die antiretrovirale (ART) Medikamente zu reduzieren. Zu diesem Zweck hat unser Labor den Grundsätzen der Nanomedizin angewendet ART zu vereinfachen und als solche zu reduzieren Toxizitäten bei gleichzeitiger Verbesserung der Compliance und Drogen Pharmakokinetik. Einfache und zuverlässige Verfahren zur Herstellung von nanoformulated ART (Nanoart) gezeigt. Partikel aus reinem Wirkstoff durch eine dünne Schicht aus Tensid-Lipid-Schicht gekapselt und produziert durch Fraktionierung größeren Medikamenten-Kristalle in kleinere von beiden Nassmahlen oder Hochdruckhomogenisation. In einem alternativen Verfahren frei Medikament ist in einem Tropfen aus einem Polymer suspendiert. Hierin ist eine medikamentöse innerhalb eines Polymers dann durch Ultraschall gerührt, bis einzelne nanometergroßen Tröpfchen gebildet werden aufgelöst. Die dynamische Lichtstreuung und mikroskopische Untersuchung charakterisieren die physikalischen Eigenschaften der Teilchen (Partikel Größe, Ladung und Form). Ihre biologischen Eigenschaften (Zelle Aufnahme und Retention, Zytotoxizität und antiretrovirale Wirksamkeit) sind mit menschlichen Monozyten-Makrophagen (MDM) bestimmt. MDM sind aus menschlichen Monozyten im peripheren Blut von leukopacks mit Zentrifugalkraft Elutriation zur Reinigung isoliert abgeleitet. Solche Blut übertragbaren Makrophagen als zelluläre Transporter für Nanoart Verteilung an humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten Organen verwendet werden. Wir postulieren, dass das Umpacken von klinisch verfügbaren antiretroviralen Medikamente in Nanopartikel für HIV-1-Behandlungen kann die Einhaltung zu verbessern und positiv beeinflussen Krankheitsverläufe.

Protocol

Nanoart Fertigung

1. Wet Milling Nanoart von NETZSCH MicroCer Methoden

1. Wiegen Sie das Medikament Kristalle und verschiedene Tenside, die verwendet werden, um die Nanoformulierungen mit einer Analysenwaage machen und mischen sie mit 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,8 mit einem T-18 Ultraturrax Mixer bis zur vollständigen Dispersion werden. 2% - Der Anteil des Medikaments in der Formulierung sollte zwischen 1 sein.
2. Für die kontinuierliche Fräsen, stellen Sie sicher, dass der Kühler und der Kompressor eingeschaltet ist. Der Ausgangsdruck soll rund 100 PSI vor Beginn der Mühle Ihrer Probe.
3. Schalten Sie die Steuereinheit und drehen Sie den Mahlbehälter, so dass die Mahlkörper in den Tank geladen werden können.
4. 50 ml der Perlen der Mahlraum mit Hilfe eines Trichters. Stellen Sie sicher, dass es keine Perlen in den Fäden oder irgendwo außerhalb der Mahlkammer zu Undichtigkeiten in der Gleitringdichtung zu vermeiden.
5. Stellen Sie sicher, dass die O-Ring an seinem Platz auf der Mahlkammer ist. Wählen Sie einen geeigneten Bildschirm Maschenweite und die entsprechenden Deckel Montage und Sicherung der Deckel durch Anziehen der Muttern. Der Bildschirm Maschenweite sollte mindestens die Hälfte der Größe der Perlen werden. Verwenden Sie einen großen Bildschirm Maschenweite, um ein Produkt von Verstopfung des Filters, während kontinuierliche Fräsen zu vermeiden.
6. Senken Sie die Mahlkammer, damit es horizontal mit dem Knopf an der Oberseite der Kammer zur Verfügung gestellt und stellen Sie sicher, dass das Produkt Auslassrohr mündet in den Auffangbehälter.
7. Fügen Sie das Medikament Aufhängung mit verschiedenen Mengen von Tensiden, um ein Produkt Einlass. Die minimale Volumen der Suspension sollte 100 ml enthält. Dies wird der Mahlraum vor Überhitzung zu verhindern und auch vermeiden, bead Kontamination durch weniger Verschleiß an Teilen
8. Starten Sie die Pumpe mit der Steuereinheit. Die Durchflussmenge kann variiert werden, wie für Ihre Formulierung (~ 50 bis 150 mL / min) erforderlich sein.
9. Schalten Sie das Rührwerk auf und passen Sie die Geschwindigkeit auf der Steuereinheit. Die Geschwindigkeit kann von 620 rpm bis 4320 rpm auf einem MicroCer erhöht werden. Überwachen Sie die Temperatur mit der Temperaturanzeige, die oben auf der Mahlkammer angebracht ist und stellen Sie sicher, dass es keine Überhitzung.
10. Mühle der Probe bei verschiedenen Geschwindigkeiten und Durchflüsse und nehmen Sie kleine Portionen (ca. 1 mL) der Formulierung für Größe und Ladung Messungen mit einem Diffraction Light Scattering Brookhaven Zetasizer (Tabelle 1).
11. Nachdem die gewünschte Größe erreicht, stoppen Sie das Fräsen mit dem Steuergerät. Mit der Pumpe immer noch auf, sammeln die Probe in einen Kolben. Lassen Sie das Medikament vollständig in die Probe Auffangkolben abtropfen lassen.
12. Schalten Sie die Pumpe. Zum Entfernen der Kugeln, statt einer Auffangwanne unter dem Gerät. Lösen Sie die Muttern an der Frontplatte des Deckels Montage und sammeln die Perlen in das Fach ein. Nehmen Sie die Frontplatte und mit einem VE-Wasser-Flasche, die Perlen in das Fach zu waschen.
13. Übertragen Sie die gemahlenen Suspension in 50 mL Zentrifugenröhrchen und stellen Sie die Zentrifuge zu 10.000 Umdrehungen pro Minute (10174 rcf) für 30 Minuten. Nach Abschluss der Zentrifuge Zyklus, messen Sie die Höhe der Überstand und ersetzen mit der gleichen Menge an frischem Tensidlösung.
14. Nach Resuspension abgeschlossen ist, übertragen Sie die Suspension auf die Mahlkammer und Mühle für 10 Minuten. Nehmen Sie ein Aliquot (~ 1 mL) und messen Sie die Größe und Ladung der Probe wieder mit dem Zetasizer (Tabelle 1).
15. Führen Sie eine post-Nutzung Reinigung der MicroCer mit deionisiertem Wasser und 70% Ethanol.
16. Messen Sie die Konzentration der Nanoart Formulierungen mittels HPLC. In unserem Fall untersuchten wir die Proben durch Reversed-Phase-HPLC mit dreifacher 20 uL Injektionen auf eine YMC Octyl C8-Säule (Waters Inc., Milford, MA) mit einem C8 Vorsäule. Mobile Phase, bestehend aus 48% Acetonitril / 52% 25 mM KH ₂ PO _4, pH 4,15 wird auf 0,4 mL / min mit UV / Vis-Detektion bei 272 nm gepumpt. Für alle Arzneimittel Messungen ist die Quantifizierung durch Vergleich mit einer Standardkurve von jedem freien Wirkstoff (0,025-100 pg / mL) in Methanol hergestellt ermittelt.

2. Nanoart Homogenisierung mit dem Avestin EmulsiFlex C5

1. Messen Sie das Medikament Kristalle und verschiedene Tenside, die verwendet werden, um die Nanoformulierungen mit einer Analysenwaage machen und mischen sie mit 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,8 mit einem T-18 Ultraturrax Mischer um eine vollständige Dispersion erhalten werden.
2. Übertragen Sie die Suspension auf die Homogenisierung Schiff und beginnen Rückführung. Stellen Sie sicher, dass der Kühler auf, bevor Sie die Probe zu homogenisieren ist
3. Erhöhen Sie den Druck schrittweise, bis das Messgerät 20.000 ± 2.000 psi liest und weiter zu homogenisieren, bis das Ziel Partikelgröße erreicht ist. Dies dauert in der Regel zwischen 45 bis 60 Minuten. Nehmen Sie ein Aliquot (~ 1 mL) in regelmäßigen Abständen und messen Sie die Größe und Ladung der Probe mit einem Zetasizer (Tabelle 1).
4. Übertragen Sie die homogenisierte Suspension aus dem Homogenisator zu 50 mL Zentrifugenröhrchen und stellen Sie die Zentrifuge zu 10.000 Umdrehungen pro Minute (10174 rcf) für 30 Minuten. Nach Abschluss derder Zentrifuge Zyklus, messen Sie die Höhe der Überstand und ersetzen mit dem gleichen Volumen frischen Tensidlösung.
5. Nach der Resuspension übertragen die Suspension auf die C5-Homogenisator. Starten Sie den Kreislauf an und geben die Homogenisierdruck zu 20.000 ± 2.000 psi und homogenisieren für 30 Minuten. Messen Sie die Größe und Ladung der Formulierung mit dem Zetasizer (Tabelle 1).
6. Führen Sie die nach Reinigung des Gerätes mit deionisiertem Wasser und Ethanol als Lösungsmittel.
7. Messen Sie die Konzentration der Proben mittels HPLC.

3. Beschallung mit dem Cole Parmer Ultraschall-Prozessor

1. Messen Sie 50 ml Dichlormethan in ein Becherglas. Maßnahme 6 g Poly (Milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) mit Hilfe der analytischen Waage, um das Dichlormethan hinzu und mischen, bis eine vollständige Auflösung zu beobachten ist.
2. Measure 1,25 g der Droge Kristalle und fügen Sie das Dichlormethan / PLGA-Lösung. Mix, um eine vollständige Auflösung zu erhalten.
3. Machen Sie 1% Polyvinylalkohol (PVA) Tensidlösung und kühlen Sie es mit einem Eisbad. Stellen Sie sicher, dass das Tensid-Lösung abgekühlt ist, bevor die Zugabe der organischen Lösung, die den gelösten Wirkstoff enthält.
4. Gießen Sie das Medikament Lösung in den 1% PVA Tensidlösung und starten Sie das Ultraschallgerät bei 50% Amplitude. Stellen Sie sicher, dass das Tensid-Lösung in einem Eisbad platziert wird. Die Amplitude des Ultraschallgeräts kann auf ~ 30% Amplitude für kleinere Chargen von Proben reduziert werden. Mit Ultraschall die Probe für 10 Minuten.
5. Nehmen Sie ein kleines Aliquot (~ 1 mL) für die Korngrößenanalyse (Tabelle 1). Wenn die Größe der Partikel größer als 1,5 um, beschallen die Probe mit 2-Minuten-Intervallen bis zu einem Maximum von 16 Minuten insgesamt. Beachten Sie die Proben unter dem Mikroskop bei 20x und dokumentieren Beobachtungen (Abbildung 1A).
6. Verwenden Sie eine Rührplatte, um eine ausreichende Wirbel für die verbleibende Suspension zu schaffen und weiter vermischen über Nacht bei Raumtemperatur.
7. Wiegen 8 g Mannit in einen Kolben und fügen 80 mL RO-Wasser. Mix bis zur vollständigen Auflösung beobachtet und bei Raumtemperatur lagern. Dies wird zur Resuspension nach Zentrifugation verwendet werden, wenn die Proben lyophilisiert werden müssen.
8. Sammeln Sie die Suspension nach 24 Stunden und strömen in 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben mit einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei 5 ° C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren eine Hälfte der Probe in 75 mL der gefilterten Umkehrosmose (RO) Wasser und die andere Hälfte in 75 ml 0,5% Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Tensid.
9. Zentrifugieren Sie die Proben erneut mit einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei 5 ° C und resuspendieren jedem der Pellets mit einem Gesamtvolumen von 20 ml Mannitol-Lösung.
10. Nach dem zweiten Resuspension, messen Sie die Größe der Partikel mit dem Zetasizer (Tabelle 1).
11. Verwenden Sie geeignete Gefäße für die verbleibende Suspension übertragen und sie in die Lyophilisator.
12. Messen Sie die Konzentration der Proben mittels HPLC.

4. Nanoart Morphologie

1. Nehmen Nanoart Federung und kurz bei 20% Amplitude beschallen für 5 Sekunden mit einem Ultraschall-Sonde. Transfer 10 ul der Suspension in 1,5 ml RO-Wasser in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 10 Sekunden.
2. Nehmen Sie einen 50 ul Probe der Wasser-Nanoart Lösung und Transfer zu einem Filtration bestehend aus einem Swinnex 13 Polypropylen Filterhalter mit einer 0,2 um Polycarbonat Filtrationsmembran (Nuclepore Track-Etched) montiert. Die Filtration Apparat ist mit 50 ul 0,2 um gefiltert destilliertem Wasser vor der Zugabe der verdünnten Arzneistoffsuspension grundiert. Das Vakuum wird dann auf das Gerät angewendet, bis das gesamte Volumen der Lösung wurde komplett vorbei Filtrationsmembran gezogen.
3. Sobald die Membran trocken ist, wird es ein Aluminium-Pin-Stub mit Doppel-Stick leitfähigen Kohlenstoff-Klebeband befestigt und Sputter mit Palladium beschichtet. Die Probe Stub wird dann aufgenommen mit, in unserem Fall, ein JEOL JSM6300F Niederspannung, Feldemission Rasterelektronenmikroskop (Abbildung 2).

5. Nanoart Visualisierung

1. Nehmen Sie das vorbereitete Nanoart Suspensionen und beschallen sie für 10 Sekunden bei 20% Amplitude mit einer Ultraschall-Sonde.
2. Werfen Sie einen Objektträger Deckgläschen und legen Sie es auf einem inversen Mikroskop. Auf dem Deckglas mix 15 ul der Nanoart Federung mit 100 ul Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugeben und durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Visualisieren Sie die Nanopartikel mit einem 20x-Objektiv (Abbildung 3).

Biology of Nanoart

6. Isolierung und Herstellung von Blut übertragbaren Monozyten und Monozyten-Makrophagen (MDM)

1. Erhalten menschlichen Monozyten durch Leukapherese von HIV-1 und Hepatitis seronegative Spender und reinigen die Zellen durch Gegenstrom-Kreiselpumpe Elutriation. Beurteilen Zelle Reinheit von Immunomarkierung mit anti-CD68 (Klon KP-1) Von Wright gefärbten Cytospins 1.
2. Kultur gereinigt Monozyten in DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem gepoolten menschlichen Serum, 1% Glutamin, 50 ug / mL Gentamicin, 10 pg / mL Ciprofloxacin und 1000 U / mL rekombinantem humanen Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF) in einer Konzentration von 1x10 ergänzt ⁶ Zellen / ml bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _2. Platte 2x10 ⁶ Zellen pro Well in 6-Well-Platten und Kultur-Zellen für 7 Tage, damit Monozyten in Makrophagen 1 zu unterscheiden. (Abbildung 3A)

7. Zellaufnahme und Sammlung

1. Mix Nanoart mit Kulturmedium (ohne MCSF) bis zu einer Endkonzentration von 100 nM und 1 ml der Behandlung Medium in jede Vertiefung.
2. Am gewünschten Zeitpunkt oder, wenn die Zellen sind voll ausgestattet mit Nanoart (Abbildung 2) geladen wird, entfernen Sie alle Behandlung mittlerer und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 ml PBS, um alle Partikel, die nicht in wurden von den Zellen aufgenommen zu entfernen. In 1 ml PBS, entfernen adhärenten Zellen vom Boden des Brunnens mit einer Zelle Heber und legen Sie sie in ein 1,7 ml Reaktionsgefäß 2-4.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 rcf bei 4 ° C für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und mit 200 ul 100% Methanol. Lyse der Zellen und lösen Nanoart durch kurzes (2-5 Sekunden) beschallt das Pellet mit einem Ultraschallbad Sonde bei 20% Amplitude. Shop-Proben in -80 ° C bis zu seiner Droge Inhalt zu analysieren.

8. Intrazelluläre Retention von Nanoart

1. Gönnen MDM wie in 7.1 beschrieben.
2. Am gewünschten Zeitpunkt, waschen Sie die Zellen wie in 7.2 beschrieben, aber anstatt sofort Schaben bis Zellen, fix Zellen für 15 min bei Raumtemperatur in einer Lösung von 3% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und weitere fix ihnen für 10 Minuten mit 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4).
3. Entfernen Fixativ und kratzen Zellen in 1 ml PBS als in 7.2 beschrieben. Auch sammeln und Zentrifuge Zellen beschreiben in 7,2; sondern der Zugabe von Methanol, das Pellet, 200 ul der Glutaraldehyd Fixierlösung.
4. Cut Zellpellet in dünne (80 nm) Abschnitte mit einem Mikrotom. Stain die Schnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat. Das angefärbte Schnitte mit Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 4).

9. ART Veröffentlichung

1. Gönnen Zellen in 7,1-7,2 beschrieben, jedoch wird statt des Sammelns Zellen nach dem Waschen, ersetzen PBS mit 2 mL Zellkulturmedium ohne MCSF und ohne Nanoart.
2. Am angegebenen Tage, oder wie von Zellkulturmedium Vergilben, Austausch Hälfte des Mediums angezeigt.
3. Am gewünschten Tag, sammeln 1 ml der Zell-Medium mit replizieren Zellen in 7,2-7,3 beschrieben.
4. Prozess-Zellen wie in 7.3 beschrieben. Medium durch Zugabe von 150 ul Medium Probe 1 ml 100% Methanol und Wirbel bei voller Geschwindigkeit für 10 Sekunden. Dann Zentrifuge die Proben mit 21.000 rcf für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und die Übertragung auf einen neuen Schlauch. Man dampft das Methanol mit einer Vakuum-Zentrifuge, dies kann dauern 1 bis 4 Stunden, abhängig von der Probe. Shop-Proben in -80 ° C bis sie für den Drogen-Analyse.

10. Real-time Aufnahme von Nanoart durch konfokale Mikroskopie

1. Nehmen Sie reifen MDM Schritt 6,2 und beschriften Sie die Zellen mit einer Zelle Kennzeichnung Lösung wie Vybrant Zellmarkierung Lösung nach der Herstellung der Anweisung. Spülen Sie die Zellen 3 mal mit 1 ml Kulturmedium, um überschüssige Farbe zu entfernen.
2. Mix Nanoart mit Kulturmedium wie in Schritt 7.1 mit fluoreszenzmarkierten Nanoart.
3. Add Behandlung Medium mit markierten Nanoart unmittelbar vor Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop. Aufnehmen eines Bildes alle 30 Sekunden für 4 Stunden mit einem 60fach-Objektiv 5 (Videos 1 & 2).

HIV-1 Infektion und Infektiosität Assays

11. HIV-1 Infektion _ADA

1. Gönnen Zellen in 9,1-9,3 beschrieben.
2. Am gewünschten Tage, entfernen Sie alle mittel-und ersetzen mit dem Medium, ohne MCSF, mit HIV-1 _ADA bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 Viruspartikel / Zelle und Inkubation für 24 Stunden 1. Entfernen Sie Virus Medium und ersetzen mit frischen, Virus-freie Medien. Kultur-Zellen für 10 Tage tauschen die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag oder als notwendig, um Zellen am Leben (Abbildung 5) 6.
3. Zehn Tage nach der Infektion zu sammeln 10 l Medium aus jeder Vertiefung, in einer 96-Well-Platte und bei -80 ° C bis zu seiner retrovirale (reverse) Transkriptase-Analyse durchzuführen.

12. Reverse Transkriptase (RT)-Assay

1. Mit jeweils 10 ul Probe aus Schritt 11.3, mix 10 ul einer Lösung, die 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% Nonyl phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), und Wasser enthält. Inkubieren diese Mischung für 15 Minuten bei 37 ° C 7.
i> Dann fügen Sie 25 ul einer Lösung, 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl _2, 0,05% NP-40, 10 ug / ml Poly (A), 0,250 enthält U / mL Oligo d (T) _12-18 und 10 Ci / ml ³ H-TTP in jede Vertiefung und inkubieren bei 37 ° C für 18 Stunden 7.
2. Nach der Inkubation mit 50 ul eiskalter 10% Trichloressigsäure (TCA) in jede Vertiefung. Ernte der Brunnen auf Glasfaserfilter und bewerten Sie die Filter für ³ H-TTP Aufnahme von β-Szintillations-Spektroskopie 7.

13. HIV-1p24 Erkennungen

1. Waschen Sie die Replikation Zellen, aus denen retrovirale Transkriptase Medium Probe in Schritt 11.3 Durch Spülen mit 1 ml PBS 3 mal wurde entfernt.
2. Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Morgen spülen Zellen 3 mal mit PBS.
3. Verwenden Sie die Maus monoklonalen Antikörpern gegen HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) der HIV-Infektion zu visualisieren. Bild Zellen unter Hellfeld mit einem 40x-Objektiv (Abbildung 6).

14. Repräsentative Ergebnisse:

Medikament	Größe (Nm)	PDI	Gebühr (Mv)	Surfactants
IDV	1052	0,286	-24,58	0,5% P188, 5,0% SDS, 9,25% Saccharose
RTV	233	0,273	-7,47	0,5% P188, 9,25% Saccharose
ATZ	840	0,192	25,47	0,5% P188, 0,1% mPEG 2000-DSPE, 1,0% DOTAP, 9,25% Saccharose
EFV	347	0,235	-13,52	1,0% PVA

Tabelle 1. Physikalische Eigenschaften von Nanoart
Die Tabelle zeigt mögliche repräsentative Werte für die physikalischen Eigenschaften des Nanoart Formulierungen hergestellt unter Verwendung der angegebenen Tenside. Die angegebenen Werte beinhalten den mittleren Durchmesser von der Intensität des gestreuten Lichts, der Polydispersitätsindex (PDI, eine Schätzung der Verteilung der Partikelgröße), und das Zetapotential-Werte für verschiedene Nanoformulierung Proben gewonnen wurden. Abkürzungen in der Tabelle verwendet: IDV: Indinavir, RTV: Ritonavir, ATV: Atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: Polyvinylalkohol; SDS Natriumdodecylsulfat; P188: Poloxamer 188 (auch als Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: Methyl-poly (Ethylen-Glykol) 1,2-Distearoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin; DOTAP: (1-Oleoyl-2-[6 - [(7-Nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] Hexanoyl] - 3-trimethylammoniumpropanchlorid.

Abb. 1 dargestellt. Flussdiagramm fasst verschiedene Methoden verwendet, um Nanoart herzustellen.
Abbildung 1 fasst verschiedene Methoden verwendet, um Nanoart herzustellen. Das Flussdiagramm enthält eine erwartete Zeit-Kontingent für jeden der kritischen Phasen der jeweiligen Methoden.

ABBILDUNG 2. Repräsentative Bilder von erwünschten und unerwünschten Nanoart Morphologie. Rasterelektronenmikroskopie Analyse (Vergrößerung, 15.000 X) von RTV Nanoart hergestellt durch Homogenisierung, Nassmahlen und Beschallung auf der Spitze eines 0,2 um Polycarbonat Filtrationsmembran. Messen bar entspricht 2,0 um in allen Frames. Wünschenswert Nanoart bestehen im Durchschnitt kleiner (≤ 2 mm) in sich geschlossene Teilchen mit glatten Kanten, die die gleiche oder eine ähnliche Form haben, neigen. Unerwünschte Nanoart variieren stark in Größe und Form und können und / oder-Stick, um miteinander zu verschmelzen.

ABBILDUNG 3. Images of wünschenswert Nanoart Lösung und der MDM Aufnahme Nanoart. Hellfeld-Mikroskopie-Aufnahmen (alle erfassten mit einem 20fach Objektiv) von homogenisierten RTV-NP und MDM Aufnahme Nanoart. Nach der Zusammenlegung der 10 ul RTV-NP-Lösung mit 100 ul PBS auf einem Deckglas, werden die Partikel sichtbar und ähneln Sand mit nur ein paar der größeren Partikel einzeln identifizierbar (A). Bild von ausdifferenzierten und spindelförmig MDM vor Nanoart Behandlung (B). Nachdem die Zellen bis Nanoart genommen haben, werden sie dunkler und ihre Kerne deutlicher durch perinukleären Verteilung der Nanoart, aber sie immer noch ihre spindelförmigen Zellkörper (C). Sobald die Zellen werden mit Nanoart, die Kerne verdeckt überlastet, und die Zellen werden gerundet, verlieren ihre spindelförmige Struktur und potenziell Ablösen von der Unterseite des Brunnens (D).

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ABBILDUNG 4. Bestätigung der zellulären Aufnahme von Nanoart in MDM. Die Transmissionselektronenmikroskopie (Vergrößerung, 15.000 x) zeigt die Aufnahme von Nanoart in MDM ausgesetzt RTV-NP von der Homogenisierung (A), RTV-NP aus Nassmahlen (B), RTV-NP von Ultraschall (C) und unbehandelten Zellen (D ). Innerhalb der Zellen, sollte die Nanoart leicht erkennbar durch ihre geometrische Form. Beachten Sie das Fehlen eines offensichtlichen geometrischen Strukturen in der Zelle steuern (D). Ein Beispiel für jedes Teilchen skizziert worden: rot für die Homogenisierung (A), blau für Nassmahlen (B), Grün für die Beschallung (C). Particle Struktur sollte ähnlich dem, was gesehen wurde mittels SEM. Messen bar entspricht 5,0 um in allen Frames.

ABBILDUNG 5. Diagramm der Verfahren zur Prüfung antiretrovirale Wirksamkeit von Nanoart. Um zu testen, die Fähigkeit der Nanoart zu hemmen die virale Replikation MDM muss zuerst mit Nanoart behandelt werden und dann ausgesetzt HIV-1 _ADA. Ähnlich wie bei der ART Release Studien, sind die MDM mit Nanoart geladen und dann gewaschen, um alle Partikel, die noch nicht verinnerlicht zu entfernen. Nanoart laden MDM werden dann bis zu 15 Tage mit einer Hälfte Mediumwechsel kultiviert jeden zweiten Tag. Während dieser Zeit (in der Regel an den Tagen 1, 5, 10 und 15) MDM sind mit HIV-1 _ADA in Frage gestellt. Nach jeder viralen Exposition Zellen für weitere 10 Tage kultiviert, damit die Infektion für den Fortschritt. Am Tag 10 nach der Infektion Medien Proben werden für RT-Analyse und die Zellen fixiert und gefärbt für p24 Antigen gesammelt. Non-Nanoart behandelt MDM, sowohl von infizierten und nicht infizierten, sind auch in parallel kultiviert und getestet auf das Vorhandensein von p24-Antigen und RT-Aktivität.

ABBILDUNG 6. Prüfung von Nanoart Wirksamkeit bei HIV-1 infizierten MDM durch p24-Färbung. Hellfeld Bilder (20fach Objektiv) von RTV-NP behandelt MDM 10 Tage, nachdem sie mit HIV-1 _ADA in Frage gestellt. Keine Infektion war dabei, als Zellen mit Virus1 Tag nach der Nanoart Behandlung (A) in Frage gestellt wurden; beachten Sie die Anwesenheit von NP im Zytoplasma der meisten Zellen (A Einschub durch Pfeile angedeutet). Die Infektion war dabei, als Zellen wurden auf Viren von 10 Tagen nach Nanoart Behandlung (B) ausgesetzt, obwohl viel weniger als die Zellen nicht mit Nanoart behandelt (D); beachten Sie die gepflegt Anwesenheit von NP in einigen Zellen (B Einsatz durch Pfeile angedeutet), aber weniger als am Tag 1 post-Nanoart Behandlung (A Kasten). Bild von Zellen, die weder mit Nanoart noch infiziert (C) behandelt wurden, zur Kenntnis Mangel an NP im Cytoplasma (C Kasten). Bild von Zellen, die nicht mit Nanoart behandelt wurden, sondern ausgesetzt HIV-1 _ADA (D).

VIDEO 1. Lebenden Zellen konfokale Mikroskopie von armen RTV-NP-Aufnahme durch MDM. Fluoreszenzmikroskopie von MDM grün gekennzeichnete und mit Vybrant DiO Zell-Kennzeichnung Lösung behandelt mit rot-markierten RTV-NP. Ein Bild wurde alle 30 Sekunden für 4 Stunden bei 60x Vergrößerung. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen

VIDEO 2. Lebenden Zellen konfokale Mikroskopie von erfolgreichen RTV-NP-Aufnahme durch MDM. Fluoreszenzmikroskopie von MDM grün gekennzeichnete und mit Vybrant DiO Zell-Kennzeichnung Lösung behandelt mit rot-markierten RTV-NP. Ein Bild wurde alle 30 Sekunden für 4 Stunden bei 60x Vergrößerung. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen

Discussion

Nanoart sind entworfen, um HIV-1-Therapeutika zu verbessern. Wir haben eine Monozyten-Makrophagen-basierte Drug-Delivery-Systems als ein erster Schritt, um diese Technologien für den klinischen Einsatz zu entwickeln und als Labor-Prüfsystem für nanoformulated Entwicklung von Medikamenten vorgeschlagen. Unsere bisherigen Arbeiten haben gezeigt, dass das System tragfähig für eine solche Anwendung ist ^5,6.

In dem aktuellen Bericht haben wir Methoden zur Synthese von NP der am häufigsten verwendeten HIV-1 Medikamente (; ritonovir, RTV, Efavirenz, EFV und Atazanavir, ATV Indinavir, IDV) dargestellt. Dies wurde durch Naßvermahlung, Homogenisierung und Ultraschall erreicht. Wichtig ist, ermöglicht es unseren Ansatz für Modifikationen Nanoart physikalischen Eigenschaften wie Größe, Form und Ladung ^5,6. Durch die sorgfältige Auswahl von Tensiden, kann man die Ladung des Teilchens von stark negativ auf neutral bis stark positive Kontrolle. Durch die Veränderung der Verarbeitung Zeit und Intensität, kann man die Größe und machen kleine Partikel ≤ 200 nm oder so groß wie ≥ 3 um. Die Form der Teilchen kann auch gesteuert werden, aber in geringerem Maße als die anderen physikalischen Eigenschaften. Zum Beispiel können kugelförmige Partikel via Ultraschall mit Polymeren hergestellt werden, während mehrseitige geometrische Formen über Nassmahlen oder Homogenisierung hergestellt werden können. Nassmahlen und Homogenisierung produzieren unterschiedlich geformte Partikel, aber dieser Prozess ist abhängig von der Fraktionierung Methode und kann nicht direkt für die gesteuert werden. Diese Eigenschaften der Herstellungsmethoden aktivieren können Forschungen auf einfache Weise zu produzieren Nanoart genaue Design-Vorgaben. Das ist unbedingt notwendig, da die physikalisch-chemischen Eigenschaften Nanoart eine starke Wirkung haben beide auf ihre Stabilität und ihre Interaktion mit Zellen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass Nanoart, dass etwa 1 &mgr; m groß sind, haben eine starke positive Ladung, und haben einen vielseitigen geometrischen Form schneller werden von Makrophagen, stabiler einmal im Inneren der Zellen aufgenommen und veröffentlicht über einen längeren Zeitraum Zeit 6.

Ein Verfahren zum Testen Nanoart wurde entwickelt, ermöglicht eine einfache Screening der Partikel 'Fähigkeit, aufgenommen werden, erhalten und veröffentlicht von Makrophagen, einer der Grundsatz Zielzellen von HIV-1, zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, die virale Replikation zu hemmen. Dies erlaubt es, leicht unterscheiden Nanoart basierend auf Leistung und diejenigen auszuwählen, die beste Chance auf Erfolg in einem In-vivo-Modell, also erhöht die Effizienz und Geschwindigkeit bei der Entwicklung Nanoart für den menschlichen Gebrauch haben.

Es hat sich gezeigt, dass Knochenmark der Maus Makrophagen, wenn ex vivo mit Nanoart geladen und adoptiv durch intravenöse Injektion in humanisierter HIV-1 infizierten Mäusen den Stellen der aktiven Infektion reisen können, einschließlich des zentralen Nervensystems, und lassen Sie Medikamente für bis zu 2 Wochen übertragen zu hemmen die virale Replikation ^2-4. Darüber hinaus wurden diese Nanoart beladenen Zellen in der Lage, effektiv reduzieren die Anzahl der Virus-infizierten Zellen im Plasma, Lymphknoten, Milz, Leber und Lunge sowie Schutz CD4 + Zellen ^2. Diese Studien, obwohl sie vorläufig, zeigen, dass eine Zell-vermittelten Nanoart Abgabesystem kann klinisch signifikante Mengen des Arzneimittels, sowohl Blut und infizierten Geweben verteilen. Aufgrund der ermutigenden vorläufigen Ergebnisse von HIV-1-infizierten Maus-Studien, sind wir derzeit die Entwicklung eines Simian Immuno Deficiency Virus infiziert Makaken-Modell weiter zu testen das Potenzial der Nanoart für den klinischen Einsatz.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
nanoART Manufacture
Indinavir sulfate	Reagent	Longshem Co., Shanghai, China	Cas # 157810-81-6
Ritonavir	Reagent	China Shengda Pharmaceutical Company, China	Cas # 155213-67-5
Atazanavir sulfate	Reagent	Gyma Laboratories of America INC	Cas # 198904-31-3
Effavirenz	Reagent	Hetero Labs LTD, India	Cas # 154598-52-4
PVA	Reagent	Sigma-Aldrich	P 8136
SDS	Reagent	Bio-Rad	161-0301
Sucrose	Reagent	Fluka	84097
P188	Reagent	Sigma-Aldrich	P 1300
mPEG 2000-DSPE	Reagent	Genzyme	LP-R4-039
Dotap	Reagent	Avanti Polar Lipid, Inc	890890 P
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	83264
PLGA 75:25	Reagent	Sigma-Aldrich	P1941
Dichloromethane	Reagent	Acros Organics	75-09-2
Mannitol	Reagent	Sigma-Aldrich	M9546
CTAB	Reagent	Sigma-Aldrich	H 9151
Analytical Balance	Tool	Denver Instrument
T-18 Mixer	Tool	IKA
Ultra Sonicator	Tool	Cole-Parmer
Wet milling, MicroCer	Tool	Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizer, EmulsiFlex-C5	Tool	Avestin, Inc.
Zetapotentiometer	Tool	Malvern Instruments
Gas Manifold System	Tool	Victor Technologies
In Vitro Testing
DMEM	Reagent	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Gentamicin	Reagent	Invitrogen	15710-064
Ciprofloxin	Reagent	Sigma-Aldrich	17850
Human MCSF	Reagent	Miltenyi Biotec	130-093-964
Pooled normal human serum	Reagent	Cole-Parmer	WU-88061-68
6-well tissue culture plates	Tool	Corning	3524
Methanol (HPLC Grade)	Reagent	Fisher Scientific	A452SK-4
1.7 ml microcentrifuge tubes	Tool	National Scientific Company	CN1700GT
Glutaraldehyde solution	Reagent	Sigma-Aldrich	49632
Osmium tetroxide solution	Reagent	Sigma-Aldrich	75632
Centrifuge 5417R	Tool	Eppendorf	022621807
F-45-30-11 fixed angle rotor	Tool	Eppendorf	022636006
HIV-1ADA	Reagent
HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody	Reagent	Dako	M0857
Microscope slide cover slips	Tool	Fisher Scientific	12-548-5P
Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1