Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated

Published: December 9, 2010 doi: 10.3791/2460
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

חלקיקים של indinavir, ritonavir, efavirenz ו atazanavir יוצרו באמצעות כרסום homogenization רטובות, ultrasonication. אלה nanoformulations, כינה קולקטיבי nanoformulated טיפול תרופתי (nanoART), העריכו macrophage מבוססי משלוח סמים. מונוציטים הנגזרות nanoART macrophage ספיגת, שימור לשחרר מתמשכת נקבעו. אלו מחקרים ראשוניים מראים את הפוטנציאל של nanoART לשימוש קליני.

Abstract

תרופות Nanoformulated יכול לשפר פרמקודינמיקה ואת הזמינות הביולוגית בעת שכיהן גם כדי להפחית את רעילות התרופה (ART) תרופות תרופתי. לשם כך במעבדה שלנו יש להחיל את העקרונות של nanomedicine כדי לפשט את משטרי לאמנות וככזה להפחית רעילות תוך שיפור פרמקוקינטיקה ציות סמים. שיטות פשוטה ואמינה לאמנות ייצור nanoformulated (nanoART) מוצגים. חלקיקים של תרופה טהור כמוסות על ידי שכבה דקה של ציפוי השומנים פעילי שטח המיוצר על ידי fractionating גבישים גדולים סמים לתוך הקטנים על ידי כרסום או רטוב או בלחץ גבוה homogenization. בשיטה חלופית תרופות בחינם הוא מושעה אגל של פולימר. בזאת, התרופה מומס בתוך פולימר נסער לאחר מכן על ידי ultrasonication עד טיפות nanosized הפרט נוצרים. פיזור אור דינאמי בדיקה מיקרוסקופית לאפיין את התכונות הפיסיקליות של החלקיקים (גודל החלקיקים, צורת תשלום). מאפיינים ביולוגיים שלהם (ספיגת התא, אצירת cytotoxicity והיעילות תרופתי) נקבעים עם מונוציטים מקרופאגים הנגזרות האנושי (MDM). MDM נגזרות האדם מונוציטים בדם ההיקפי מבודד leukopacks באמצעות elutriation צנטריפוגלי לטיהור. כזה דם שמקורן מקרופאגים יכולים לשמש מובילי הסלולר עבור הפצת nanoART לנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) איברים נגועים. אנו מניחים כי אריזה מחדש של תרופות תרופתי זמין קלינית לתוך חלקיקים של HIV-1 טיפולים עשוי לשפר את התאימות להשפיע בצורה חיובית על תוצאות המחלה.

Protocol

NanoART ייצור

1. כרסום NanoART רטוב על ידי NETZSCH MicroCer שיטות

  1. לשקול את הגבישים סמים פעילי שטח שונים אשר ישמשו על מנת להפוך את nanoformulations באמצעות איזון אנליטיים לערבב אותם עם חיץ 10 mM Hepes, pH 7.8 באמצעות T-18 מיקסר Ultraturrax עד מפוזרים לגמרי. האחוזים של התרופה בניסוח צריך להיות בין 1 ל - 2%.
  2. עבור כרסום מתמשך, לוודא כי ילר ואת מדחס פועל. הלחץ לשקע צריך להיות סביב 100 PSI לפני שמתחילים טחנת מדגם שלך.
  3. הפעל את יחידת הבקרה וסובב את הטנק שחיקה, כך התקשורת שחיקה ניתן לטעון בתוך הטנק.
  4. הוסף 50 מ"ל של חרוזים לחדר שחיקה באמצעות משפך. ודא כי אין חרוזים בחוטי או בכל מקום מחוץ לחדר שחיקה כדי למנוע דליפות של החותם מכני.
  5. ודא O-Ring היא במקומה על תא טחינה. בחירת גודל המסך המתאים רשת ולהשתמש הרכבה מכסה מתאים ובטוח את המכסים על ידי הידוק אגוזים. גודל מסך רשת צריך להיות לפחות בגודל של חצי החרוזים. השתמש בגודל מסך גדול רשת, כדי למנוע את המוצר סתימת מסנן תוך כרסום מתמשך.
  6. מנמיכים את תא שחיקה לעשות את זה אופקי באמצעות כפתור מסופק על החלק העליון של החדר ולוודא כי שקע מוצר הצינור מרוקן לתוך כלי האיסוף.
  7. מוסיפים את ההשעיה התרופה עם כמויות שונות של חומרים פעילי שטח עד כניסת המוצר. היקף מינימלי של ההשעיה צריך להיות 100 מ"ל. זה ימנע את החדר כרסום התחממות יתר וכן להימנע מזיהום חרוז עקב בלאי פחות חלקים
  8. הפעל את המשאבה באמצעות יחידת הבקרה. קצב זרימת יכולים להיות מגוונים, כנדרש על ניסוח שלכם (~ 50-150 mL / min).
  9. סובבו את תועמלן על ולהתאים את מהירות על יחידת הבקרה. מהירות ניתן עלה מ 620 סל"ד עד 4320 סל"ד על MicroCer. צג הטמפרטורה באמצעות מד טמפרטורה המצורף על גבי על החדר שחיקה לוודא שאין התחממות יתר לא.
  10. מיל המדגם במהירויות שונות ספיקה ולהוציא aliquots קטן (~ 1 מ"ל) של גיבוש עבור מדידות גודל תשלום באמצעות פיזור השתברות אור ברוקהייבן Zetasizer (טבלה 1).
  11. לאחר בגודל הרצוי מתקבל, לעצור את כרסום באמצעות יחידת הבקרה. עם המשאבה עדיין, לאסוף את הדגימה לתוך בקבוק. אפשר התרופה לחלוטין לנקז לתוך הבקבוק אוסף המדגם.
  12. כבה את המשאבה. כדי להסיר את החרוזים, במקום מגש איסוף מתחת ליחידה. שחרר את האגוזים על הצלחת מול הרכבה את המכסה לאסוף את החרוזים במגש. תוריד את הלוח הקדמי ולהשתמש בקבוק מים כדי לשטוף את deionized חרוזים לתוך המגש.
  13. מעבירים את ההשעיה הסתובבו בתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ולהגדיר את צנטריפוגות כדי סל"ד 10,000 (10,174 RCF) במשך 30 דקות. עם השלמת המחזור צנטריפוגות, למדוד את כמות supernatant ולהחליף אותה כמות של פתרון פעילי שטח טריים.
  14. לאחר resuspension תושלם, להעביר את ההשעיה לחדר כרסום במפעל במשך 10 דקות. קח aliquot (~ 1mL) ולמדוד את גודל תשלום של המדגם שוב באמצעות Zetasizer (טבלה 1).
  15. בצע ניקוי שלאחר השימוש MicroCer באמצעות מים deionized ו 70% אתנול.
  16. למדוד את ריכוז של ניסוחים nanoART באמצעות HPLC. במקרה שלנו, אנו העריכו את דגימות ידי התהפכה שלב HPLC בשלושה עותקים באמצעות 20 זריקות μL על טור YMC C8 octyl (ווטרס Inc, Milford, MA) עם שומר C8 מחסנית. בשלב נייד המורכב אצטוניטריל 48% / 52% 25mm KH 2 PO 4, pH 4.15 נשאבים על 0.4 mL / min עם זיהוי UV / Vis ב 272 ננומטר. עבור כל המדידות סמים, quantitation נקבע על ידי השוואה עקומת סטנדרט של כל תרופה בחינם (0.025-100 מיקרוגרם / מ"ל) שהוכנו מתנול.

2. NanoART homogenization באמצעות EmulsiFlex Avestin C5

  1. מדוד את הגבישים סמים פעילי שטח שונים אשר ישמשו על מנת להפוך את nanoformulations באמצעות איזון אנליטיים לערבב אותם עם חיץ 10 mM Hepes, pH 7.8 באמצעות T-18 מיקסר Ultraturrax להשיג פיזור מוחלט.
  2. מעבירים את ההשעיה לכלי השיט שמאחד ולהתחיל recirculation. ודא כי ילר הוא על לפני שמתחילים homogenize המדגם
  3. להגביר את הלחץ בהדרגה עד מטר קורא 20,000 ± 2,000 psi ולהמשיך homogenize עד גודל החלקיקים היעד יושג. זה בדרך כלל לוקח בין 45-60 דקות. קח aliquot (~ 1mL) מעת לעת ולמדוד את גודל המדגם תשלום באמצעות Zetasizer (טבלה 1).
  4. מעבירים את ההשעיה הומוגני מ homogenizer עד 50 מבחנות צנטריפוגה מ"ל ולהגדיר את צנטריפוגות כדי סל"ד 10,000 (10,174 RCF) במשך 30 דקות. עם השלמתמחזור צנטריפוגות, למדוד את כמות supernatant ולהחליף עם נפח שווה של פתרון פעילי שטח טריים.
  5. לאחר resuspension, להעביר את ההשעיה על homogenizer C5. הפעל מחדש את זרימת הדם ולהחזיר את הלחץ שמאחד עד 20,000 ± 2,000 psi ו homogenize במשך 30 דקות. מדוד את גודל הממונה על גיבוש באמצעות Zetasizer (טבלה 1).
  6. בצע ניקוי פוסט היחידה עם מים אתנול deionized וככל ממס.
  7. למדוד את ריכוז של דגימות באמצעות HPLC.

3. Sonication באמצעות מעבד מבני הזוג קול Ultrasonic

  1. מדדו 50 מ"ל של dichloromethane לתוך כוס זכוכית. 6 מדוד גרם של פולי (לקטית, חומצה גליקולית שיתוף) (PLGA) באמצעות איזון אנליטית, להוסיף dichloromethane, ומערבבים עד המסה מוחלטת הוא ציין.
  2. מדוד 1.25 גרם של גבישי התרופה ולהוסיף dichloromethane / פתרון PLGA. מערבבים להשיג פירוק מלא.
  3. הפוך 1% אלכוהול פוליוויניל (PVA) פתרון פעילי שטח מגניב זה באמצעות אמבט קרח. ודא כי פתרון פעילי שטח מגניב לפני תוספת של הפתרון אורגני המכיל את התרופה מומס.
  4. יוצקים את פתרון הסמים לתוך הפתרון PVA 1% פעילי שטח ולהתחיל את ultrasonicator על משרעת של 50%. ודא כי פתרון פעילי שטח ממוקם באמבט קרח. משרעת של sonicator ניתן לצמצם משרעת ~ 30% עבור קבוצות קטנות יותר של דגימות. Sonicate המדגם במשך 10 דקות.
  5. הוצא aliquot קטן (~ 1 מ"ל) לניתוח גודל החלקיקים (טבלה 1). אם גודל החלקיקים גדול מ -1.5 מיקרומטר, sonicate המדגם ב -2 דקות במרווחים עד למקסימום של 16 דקות בסך הכל. שים לב דגימות במיקרוסקופ על 20x ותצפיות מסמך (איור 1A).
  6. השתמשו בצלחת ומערבבים כדי ליצור מערבולת נאותה ההשעיה הנותרים וממשיכים לערבב למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  7. לשקול 8 גרם מניטול לתוך בקבוק ולהוסיף 80 מ"ל מים RO. מערבבים עד המסה מוחלטת הוא ציין ולאחסן בטמפרטורת החדר. זה ישמש resuspension לאחר צנטריפוגה אם דגימות צריך להיות lyophilized.
  8. אסוף את ההשעיה לאחר 24 שעות ויוצקים 50 צינורות צנטריפוגה מ"ל. צנטריפוגה דגימות במהירות של 8000 סל"ד במשך 20 דקות ב 5 ° C. למזוג supernatant ו resuspend מחצית המדגם ב 75 מ"ל של אוסמוזה הפוכה מסוננים (RO) מים ואת החצי השני ב 75 מ"ל של ברומיד 0.5% trimethylammonium פעילי שטח cetyl (CTAB).
  9. צנטריפוגה דגימות שוב במהירות של 8000 סל"ד במשך 20 דקות ב 5 ° C ו resuspend כל כדורי עם סך של 20 מ"ל פתרון מניטול.
  10. לאחר resuspension השני, למדוד את גודל החלקיקים באמצעות Zetasizer (טבלה 1).
  11. השתמש צלוחיות מתאים להעביר את ההשעיה הנותרים ולהכניס אותם לתוך lyophilizer.
  12. למדוד את ריכוז של דגימות באמצעות HPLC.

4. NanoART מורפולוגיה

  1. קח ההשעיה nanoART ובקצרה sonicate ב משרעת 20% למשך 5 שניות עם בדיקה sonication. העברת 10 μL של ההשעיה תוך 1.5 מ"ל מים RO בתוך צינור 1.7 מ"ל microcentrifuge ו מערבולת למשך 10 שניות.
  2. קחו לדוגמה 50 μL של מים פתרון nanoART ולהעביר מנגנון סינון המורכב בעל Swinnex 13 מסנן פוליפרופילן התאספו עם קרום 0.2 סינון פוליקרבונט מיקרומטר (Nuclepore עקוב אחר חרוט). מנגנון הסינון ערוכה עם 50 0.2μm μL סינון מים מזוקקים לפני תוספת של השעיה התרופה בדילול מלא. אבק מוחל אז למנגנון עד נפח פתרון שלם כבר משכה לחלוטין האחרונות סינון הממברנה.
  3. לאחר קרום יבש, היא מודבקת בדל אלומיניום פינים באמצעות מקל כפול מוליך קלטת פחמן גמגום מצופה פלדיום. בדל הדגימה הוא אז צילמו באמצעות, במקרה שלנו, JSM6300F JEOL מתח נמוך, פליטת שדה סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2).

5. NanoART ויזואליזציה

  1. קח את המתלים nanoART מוכן sonicate אותם למשך 10 שניות ב 20% עם משרעת בדיקה sonication.
  2. קחו לכסות שקופיות מיקרוסקופ להחליק ומקם אותה על מיקרוסקופ הפוכה. ב להחליק את המכסה לערבב 15 μL של ההשעיה nanoART עם μL 100 של בופר פוספט (PBS) ומערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דמיינו את חלקיקי באמצעות המטרה 20x (איור 3).

ביולוגיה של nanoART

6. בידוד הכנת המקרופאגים דם ברנה מונוציטים ו-derived מונוציטים (MDM)

  1. השג מונוציטים אנושיים על ידי leukapheresis של HIV-1 ותורמים הפטיטיס seronegative ולטהר את התאים על ידי elutriation נגדית הנוכחית צנטריפוגלי. הערכת טוהר התא על ידי immunolabeling עם אנטי CD68 (שיבוט KP-1) מ רייט מוכתם cytospins 1.
  2. מונוציטים תרבות מטוהרים ב DMEM בתוספת חום מומת 10% נסיוב אדם ונקווה, גלוטמין 1%, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1000 ציפרופלוקסאצין U / mL מושבה רקומביננטי אנושי macrophage גורם מגרה (MCSF) בריכוז של 1x10 6 תאים / מ"ל ב 37 ° C באווירה humidified עם 5% CO 2. פלייט 2x10 6 תאים לכל היטב צלחות 6 תאים היטב בתרבות למשך 7 ימים על מנת לאפשר מונוציטים להתמיין מקרופאגים 1. (איור 3A)

7. תא ספיגת ואיסוף

  1. מערבבים nanoART עם התקשורת והתרבות (ללא MCSF) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום טיפול טוב אחד.
  2. באותה נקודת זמן הרצויה, או כאשר תאים טעון עם nanoART (איור 2), להסיר את כל אמצעי הטיפול לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS להסיר חלקיקים לא ננקטו על ידי התאים. ב 1 מ"ל של PBS, להסיר תאים חסיד מתחתית הבאר באמצעות מרים תא ולמקם אותם לתוך צינור 1.7 מ"ל microcentrifuge 2-4.
  3. צנטריפוגה התאים RCF ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף 200 μL של מתנול 100%. Lyse להמיס את התאים nanoART על ידי לחיצה קצרה (2-5 שניות) sonicating גלולה עם בדיקה sonicating ב משרעת 20%. דגימות חנות ב -80 ° C עד מוכן לנתח את תוכן סמים.

8. שייר תאיים של NanoART

  1. התייחס MDM כמתואר 7.1.
  2. בנקודה הזמן הרצוי, לשטוף תאים כמתואר 7.2, אבל במקום מיד מגרדים את התאים, התאים לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתמיסה של 3% glutaraldehyde במאגר M 0.1 פוספט (pH 7.4) ו נוספת לתקן אותם למשך 10 דקות עם tetroxide אוסמיום 1% חיץ M 0.1 פוספט (pH 7.4).
  3. הסר מקבע ותאי לגרד ב 1 מ"ל PBS כמתואר 7.2. כמו כן, לאסוף צנטריפוגות תאים כמו לתאר 7.2, אבל במקום להוסיף מתנול על גלולה, להוסיף 200 μL של הפתרון מקבע glutaraldehyde.
  4. גזור תא גלולה לתוך רזה (80 ננומטר) קטעים עם microtome. הכתם בסעיפים עם אצטט uranyl ו ציטראט להוביל. שימו לב סעיפים מוכתם שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 4).

9. ART שחרור

  1. פנקו את התאים כמתואר 7.1-7.2, אולם במקום איסוף תאים לאחר הכביסה, להחליף PBS עם 2 בינוני תא תרבות מ"ל ללא MCSF וללא nanoART.
  2. בימים המצוין, או כפי שצוין על ידי המדיום הסלולרי תרבות מפנה חצים כתום, בתמורה של המדיום.
  3. באותו יום הרצוי, לאסוף 1 מ"ל של המדיום הסלולרי יחד עם תאים לשכפל כמתואר 7.2-7.3.
  4. תאים תהליך כמתואר 7.3. תהליך בינוני על ידי הוספת 150 μL המדגם בינוני עד 1 מ"ל של מתנול 100% מערבולת במלוא המהירות למשך 10 שניות. ואז בצנטריפוגה דגימות RCF 21,000 במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולהעביר אותו בצינור חדש. לאדות את מתנול עם צנטריפוגות ואקום, זה יכול לקחת 1-4 שעות, תלוי במדגם. חנות דגימות -80 ° C עד מוכן לניתוח סמים.

10. בזמן אמת של ספיגת NanoART ידי מיקרוסקופיה confocal

  1. קח MDM בוגרת משלב 6.2 ואת התווית תאים באמצעות תיוג תא פתרון כגון הפתרון תיוג Vybrant Cell הבאים ההוראה של ייצור. יש לשטוף את התאים 3 פעמים באמצעות 1 מ"ל של מדיום תרבות להסיר עודפי צבע.
  2. מערבבים עם nanoART בינוני תרבות כמו בשלב 7.1 באמצעות nanoART שכותרתו fluorescently.
  3. הוסף בינוני טיפול nanoART מתויג מיד לפני דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal. לכידת תמונה כל 30 שניות במשך 4 שעות שימוש המטרה 60x 5 (וידאו 1 & 2).

HIV-1 זיהום מבחני infectivity

11. HIV-1 ADA זיהום

  1. פנקו את התאים כמתואר 9.1-9.3.
  2. בימים הרצוי, להסיר את כל מדיום ולהחליף בינוני, ללא MCSF, המכיל HIV-1 ADA על ריבוי של זיהום של 0.01 חלקיקים נגיפיים / תא דגירה למשך 24 שעות 1. הסר בינוני ויראלי ולהחליף טריים, מווירוסים התקשורת. התרבות תאים במשך 10 ימים מחליפים במחצית בינוני בכל יום אחר או כפי שיידרש כדי לשמור על התאים החיים (איור 5) 6.
  3. עשרה ימים לאחר ההדבקה לאסוף 10 μL של המדיום מבאר כל מקום צלחת 96-היטב, לאחסן ב -80 ° C עד מוכן לבצע ניתוח retroviral (הפוכה) transcriptase.

12. Reverse transcriptase (RT) Assay

  1. עם מדגם 10 כל μL משלב 11.3, לערבב 10 μL של פתרון המכיל 100 מ"מ טריס-HCl (pH 7.9), 300 מ"מ KCl, 10 mM DTT, 0.1% nonyl phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), ומים. דגירה את התערובת למשך 15 דקות ב 37 ° C 7.
    2. i> לאחר מכן להוסיף 25 μL של פתרון המכיל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.9), 150 מ"מ KCl, DTT 5 מ"מ, 15 מ"מ MgCl 2, 0.05% NP-40, 10 מיקרוגרם / מ"ל פולי (א), .250 U / mL אוליגו ד (T) 12-18, ו -10 μCi / mL 3 H-TTP זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות 7.
  2. לאחר דגירה, להוסיף 50 μL של חומצה קרח קר Trichloroacetic 10% (TCA) היטב כל אחד. קציר הבארות על מסנני סיבי זכוכית, ולהעריך את המסננים עבור התאגדות H-TTP 3 על ידי scintillation-β ספקטרוסקופיה 7.

13. HIV-1p24 לתגליות

  1. לשטוף את התאים לשכפל שממנו מדגם retroviral בינוני transcriptase הוסר בשלב 11.3 ע"י שטיפה של 1 מ"ל PBS 3 פעמים.
  2. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. למחרת בבוקר לשטוף התאים 3 פעמים עם PBS.
  3. נוגדנים חד שבטיים השתמש בעכבר כדי HIV-1 p24 (01:10, Dako, Carpinteria, CA) כדי להמחיש הידבקות ב-HIV. תמונה תאים מתחת לשדה בהיר באמצעות המטרה 40X (איור 6).

14. נציג תוצאות:

תרופה גודל
(ננומטר) 		פ"ד תשלום
(MV) 		פעילי שטח
IDV 1052 0.286 -24.58 0.5% P188, 5.0% SDS, סוכרוז 9.25%
RTV 233 0.273 -7.47 P188 0.5%, 9.25% סוכרוז
ATZ 840 0.192 25.47 0.5% P188, 0.1% MPEG-2000 DSPE, DOTAP 1.0%, 9.25% סוכרוז
EFV 347 0.235 -13.52 1.0% PVA

טבלה 1. המאפיינים הפיזיים של nanoART
טבלה מציגה ערכים נציג פוטנציאל המאפיינים הפיזיים של ניסוחים nanoART מיוצרים באמצעות פעילי שטח המצוין. הערכים כוללים את קוטר ממוצע המבוסס על עוצמת אור מפוזר, מדד polydispersity (פ"ד, אומדן של התפלגות גודל החלקיקים), ואת ערכי פוטנציאל זטה שהתקבלו דגימות nanoformulation שונים. קיצורים השתמשו בטבלה: IDV: indinavir; RTV: ritonavir: טרקטורונים: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS סולפט dodecyl נתרן; P188: poloxamer 188 (המכונה גם Pluronic F68); MPEG-2000 DSPE: methyl-poly (אתילן גליקול,) 1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-Nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-י.ל.) אמינו] hexanoyl] - 3-trimethylammonium פרופאן.

איור 1
באיור 1. תרשים זרימה המסכם את השיטות השונות המשמשים לייצור nanoART.
איור 1 מסכם את השיטות השונות המשמשים לייצור nanoART. תרשים זרימה הכולל הצפוי בזמן ההקצאה עבור כל אחד השלבים הקריטיים של שיטות בהתאמה.

איור 2
איור 2. תמונות נציג מורפולוגיה NanoART רצוי ולא רצוי. ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (, הגדלה 15,000 X) של RTV nanoART המיוצר על ידי homogenization, טחינה רטובה, sonication על גבי קרום 0.2 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון. בר מדידה שווה 2.0 מיקרומטר כל המסגרות. NanoART רצוי מורכב, בממוצע, של קטן (≤ 2 מיקרומטר) עצמאי חלקיקים עם קצוות חלקים אשר נוטים להיות בעלי צורה זהה או דומה. NanoART רצויות להשתנות במידה רבה בגודל וגם הצורה יכול הפתיל ו / או לדבוק זה בזה.

איור 3
איור 3. תמונות של פתרון nanoART רצוי של MDM תופס nanoART. מוארת במיקרוסקופ שדה תמונות (נרכשה באמצעות כל מטרה 20x) של הומוגני RTV-NP ו - MDM תופס nanoART. אחרי 10 μL שילוב של פתרון RTV-NP עם μL 100 של PBS על גבי תלוש כיסוי זכוכית, חלקיקים נראים ומזכירים חול עם רק כמה חלקיקים גדולים יותר להיות מזוהה בנפרד (A). תמונה של הבדיל באופן מלא MDM ציר בצורת nanoART לפני הטיפול (B). אחרי התאים לקחו את nanoART, הם הופכים להיות כהה יותר גרעינים שלהם לעין יותר בשל הפצת perinuclear של nanoART, אולם הם עדיין לשמור בצורת כישור שלהם תא בגוף (C). לאחר התאים להיות עמוסה עם nanoART, הגרעינים להיות מוסתר, והתאים להיות מעוגל, לאבד את המבנה ציר בצורת שלהם ואפשרות ניתוק מתחתית הבאר (ד ').

4 "/>
איור 4. אישור ההתאגדות הסלולר של nanoART אל MDM. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (, הגדלה 15,000 x) מדגים קליטת nanoART אל MDM חשופים RTV-NP מ homogenization (A), RTV-NP של כרסום רטוב (B), RTV-NP מ sonication (C), תאים שלא טופלו (ד ' ). בתוך התאים, nanoART צריך להיות מזוהה בקלות על ידי הצורה הגיאומטרית שלהם. הערה העדר כל מבנים גיאומטריים ברור בתא השליטה (ד '). דוגמה של כל חלקיק כבר התווה: אדום homogenization (A), כחול רטוב טחינה (ב), ירוק sonication (C). מבנה החלקיקים צריכה להיות דומה אשר נתפס באמצעות SEM. בר מדידה שווה 5.0 מיקרומטר כל המסגרות.

איור 5
איור 5. דיאגרמה של שיטה לבדיקת יעילות של nanoART תרופתי. על מנת לבחון את היכולת של nanoART לעכב MDM השכפול הנגיפי יש להתייחס תחילה עם nanoART ואז נחשף HIV-1 ADA. בדומה ללימודי לשחרר לאמנות, MDM נטענים עם nanoART ולאחר מכן לשטוף ולהסיר כל החלקיקים לא הופנמו. NanoART עמוס MDM הם מתורבתים אז עד 15 ימים עם חילופי בינוני וחצי מדי יום שני. במהלך תקופה זו (בדרך כלל בימים 1, 5, 10, 15) MDM מאותגרים עם HIV-1 ADA. לאחר כל חשיפה תאים בתרבית הם נגיפי עוד 10 ימים כדי לאפשר התקדמות הזיהום. ביום 10 לאחר הפגיעה דגימות התקשורת נאספים לצורך ניתוח RT תאים קבוע מוכתם עבור אנטיגן p24. Non-MDM nanoART מטופלים, הן נגוע נגוע, הם מתורבתים גם במקביל נבדק לנוכחות של אנטיגן p24 ופעילות RT.

איור 6
איור 6. בדיקה של יעילות nanoART ב MDM-HIV-1 נגוע מכתים p24. תמונות שדה מוארת (20x אובייקטיבי) של RTV-NP טופלו MDM 10 ימים לאחר מאותגר עם HIV-1 ADA. הזיהום לא היה נוכח כאשר תאים היו תיגר עם טיפול virus1 ביום שלאחר nanoART (א); לציין את נוכחותו של NP בתוך הציטופלסמה של רוב התאים (הבלעה מסומנים בחיצים). הזיהום היה נוכח כאשר התאים נחשפו לנגיף 10 ימים לאחר הטיפול nanoART (ב), אם כי הרבה פחות מאשר תאים שלא טופלו nanoART (ד); לציין את נוכחותו של NP נשמר בכמה תאים (ב הבלעה מסומנים על ידי חצים), אך פחות מ 1 בכל טיפול שלאחר nanoART היום (א 'הבלעה). תמונה של תאים שטופלו לא עם nanoART ולא נגוע (ג); חוסר לב NP בתוך הציטופלסמה תא (C הבלעה). תמונה של תאים שלא טופלו nanoART אבל חשופים HIV-1 ADA (ד ').

VIDEO 1. חיה מיקרוסקופית תא confocal של ספיגת RTV-NP עניים על ידי MDM. פלורסנט מיקרוסקופית של MDM שכותרתו ירוק עם פתרון Vybrant התא תיוג Dio ו שטופלו אדום שכותרתו RTV-NP. תמונה אחת צולמה כל 30 שניות במשך שעה 4 בהגדלה 60x. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

וידאו 2. חיה מיקרוסקופית תא confocal של ספיגת RTV-NP מוצלח על ידי MDM. פלורסנט מיקרוסקופית של MDM שכותרתו ירוק עם פתרון Vybrant התא תיוג Dio ו שטופלו אדום שכותרתו RTV-NP. תמונה אחת צולמה כל 30 שניות במשך שעה 4 בהגדלה 60x. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

Discussion

NanoART נועדו לשפר HIV-1 הרפוי. יש לנו הצעת מונוציטים-macrophage המערכת מבוססת משלוח סמים כצעד ראשון לפתח טכנולוגיות כאלה לשימוש קליני כמערכת בדיקות מעבדה לפיתוח התרופה nanoformulated. העבודות האחרונות שלנו הראו כי המערכת אינה בת קיימא עבור יישום כזה 5,6.

בדו"ח הנוכחי, הדגמנו שיטות סינתזה של NP נפוץ HIV-1 תרופות (indinavir, IDV; ritonovir, RTV, efavirenz, EFV ו atazanavir, טרקטורונים). זו הושגה על ידי כרסום homogenization רטובות, ultrasonication. חשוב לציין, הגישה שלנו מאפשרת שינוי של מאפיינים פיזיים nanoART כגון צורה, גודל, ואת תשלום 5,6. על ידי בחירה זהירה של חומרים פעילי שטח, ניתן לשלוט על תשלום של החלקיקים מן שלילי מאוד נייטרלי חיובי מאוד. על ידי שינוי זמן עיבוד אינטנסיביות, ניתן לשלוט על גודל ו לדקלם חלקיקים קטנים כמו ≤ 200 ננומטר או גדול כמו ≥ 3 מיקרומטר. הצורה של החלקיקים יכולים גם להיות נשלט, אבל במידה פחותה יותר מאשר מאפיינים פיזיים אחרים. לדוגמה, חלקיקים כדוריים יכול להתבצע באמצעות sonication עם פולימרים זמן רב צדדית צורות גיאומטריות ניתן לייצר באמצעות כרסום homogenization או רטוב. כרסום homogenization רטוב לייצר חלקיקים בצורת אחרת, אבל תהליך זה תלוי בשיטת חלוקה ולא ניתן לשלוט ישירות. אלה המאפיינים של שיטות ייצור יכול לאפשר מחקרים בקלות לייצר nanoART למפרט העיצוב המדויק. זה חשוב ביותר שכן מאפייני physicochemical של nanoART יש השפעה רבת עוצמה על יציבות הן שלהם וכיצד הם מתקשרים עם תאים. לדוגמה, אנו הראו כי nanoART כי כ 1 מיקרומטר בגודל, יש מטען חיובי חזק, יש צורה גיאומטרית multisided נלקחים במהירות רבה יותר על ידי מקרופאגים, יציבה יותר פעם בתוך התאים, ושוחרר על פני תקופה ארוכה יותר זמן 6.

שיטה לבדיקה nanoART פותחה המאפשר הקרנת פשוטה של ​​יכולתם של חלקיקים להילקח למעלה, שמר, ושוחרר על ידי מקרופאגים, אחד למקד תאים העיקרון של HIV-1, בנוסף ליכולתם לעכב שכפול נגיפי. זה מאפשר בקלות להבחין nanoART בהתבסס על הביצועים ולזהות את אלה שיש להם את הסיכוי הטוב ביותר להצליח במודל vivo, ובכך להגדיל הן את יעילות ומהירות בפיתוח nanoART לשימוש בבני אדם.

הוכח כי עצם עכבר מקרופאגים מח כאשר נטען vivo לשעבר עם nanoART והועברו adoptively אנושי לתוך HIV-1 עכברים נגועים יכול לנסוע לאתרים של זיהום פעיל, כולל מערכת העצבים המרכזית, תרופות לשחרר עד 2 שבועות על ידי הזרקה תוך ורידית לעכב שכפול נגיפי 2-4. בנוסף, תאים אלה טעון nanoART היו גם מסוגל להפחית ביעילות את המספרים של תאים הנגועים בנגיף בפלסמה, בלוטות הלימפה, הטחול, הכבד והריאות, כמו גם להגן על תאים מסוג CD4 + 2. מחקרים אלה, אם כי ראשונית, להוכיח כי תא בתיווך מערכת המסירה nanoART יכול להפיץ כמויות משמעותיות קלינית של התרופה בדם וגם רקמות נגועים. בגלל התוצאות הראשוניות מעודדות מ HIV-1 מחקרים עכבר נגוע, אנחנו נמצאים כרגע בפיתוח חיסונית וירוס קוף מקוק חסר מודל נגוע כדי להמשיך לבחון את הפוטנציאל של nanoART לשימוש קליני.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי מענקים 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 ו P01 NS43985 (עד HEG) מן המכון הלאומי לבריאות. המחברים מודים לגב 'רובין טיילור עבור קריאה ביקורתית של כתב היד ותמיכה גרפי ספרותית יוצאת דופן. ברצוננו להודות סטיב Grzelak עבור המומחיות שלו כרסום רטוב. אנחנו רוצים גם להודות לד"ר האן חן מאוניברסיטת נברסקה לינקולן מתקן הגרעין במיקרוסקופ אלקטרונים לאספקת סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים תמונות. לבסוף, אנו רוצים להודות מייגן מרקוורט עבור המומחיות שלה באמצעות מיקרוסקופיה confocal לחיות.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
nanoART Manufacture
Indinavir sulfate Reagent Longshem Co., Shanghai, China Cas # 157810-81-6
Ritonavir Reagent China Shengda Pharmaceutical Company, China Cas # 155213-67-5
Atazanavir sulfate Reagent Gyma Laboratories of America INC Cas # 198904-31-3
Effavirenz Reagent Hetero Labs LTD, India Cas # 154598-52-4
PVA Reagent Sigma-Aldrich P 8136
SDS Reagent Bio-Rad 161-0301
Sucrose Reagent Fluka 84097
P188 Reagent Sigma-Aldrich P 1300
mPEG 2000-DSPE Reagent Genzyme LP-R4-039
Dotap Reagent Avanti Polar Lipid, Inc 890890 P
Hepes Reagent Sigma-Aldrich 83264
PLGA 75:25 Reagent Sigma-Aldrich P1941
Dichloromethane Reagent Acros Organics 75-09-2
Mannitol Reagent Sigma-Aldrich M9546
CTAB Reagent Sigma-Aldrich H 9151
Analytical Balance Tool Denver Instrument
T-18 Mixer Tool IKA
Ultra Sonicator Tool Cole-Parmer
Wet milling, MicroCer Tool Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizer, EmulsiFlex-C5 Tool Avestin, Inc.
Zetapotentiometer Tool Malvern Instruments
Gas Manifold System Tool Victor Technologies
In Vitro Testing
DMEM Reagent Mediatech, Inc. 10-013-CV
Gentamicin Reagent Invitrogen 15710-064
Ciprofloxin Reagent Sigma-Aldrich 17850
Human MCSF Reagent Miltenyi Biotec 130-093-964
Pooled normal human serum Reagent Cole-Parmer WU-88061-68
6-well tissue culture plates Tool Corning 3524
Methanol (HPLC Grade) Reagent Fisher Scientific A452SK-4
1.7 ml microcentrifuge tubes Tool National Scientific Company CN1700GT
Glutaraldehyde solution Reagent Sigma-Aldrich 49632
Osmium tetroxide solution Reagent Sigma-Aldrich 75632
Centrifuge 5417R Tool Eppendorf 022621807
F-45-30-11 fixed angle rotor Tool Eppendorf 022636006
HIV-1ADA Reagent
HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody Reagent Dako M0857
Microscope slide cover slips Tool Fisher Scientific 12-548-5P

Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
  2. Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
  3. Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
  4. Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
  5. Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
  6. Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
  7. Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).

Tags

אימונולוגיה גיליון 46 NanoART תרופתי HIV / איידס מונוציטים / מאקרופאגים כרסום רטוב homogenization ultrasonication
שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balkundi, S., Nowacek, A. S., Roy,… More

Balkundi, S., Nowacek, A. S., Roy, U., Martinez-Skinner, A., McMillan, J., Gendelman, H. E. Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs. J. Vis. Exp. (46), e2460, doi:10.3791/2460 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter