Summary

器官型海馬切片培養

Published: February 03, 2011
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Summary

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。

Abstract

海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション1の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強(LTP)と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ​​ことができますし、学習と記憶2の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬3のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の4を研究する古典的なモデルシステムてきた。

海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。

ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染5,6またはbiolistics 7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ​​ッセイ8用に回収できる、またはイメージング9または電気生理学的実験10の顕微鏡に転送する。

Protocol

1。海馬スライスの準備を開始する前に。 テフロンシートの部分を置き、新​​しいブレードを取り付けることで、組織スライサーを準備します。 70%エタノールで組織培養(TC)フードを拭き、解剖顕微鏡の内部に設定してください。フード、顕微鏡、組織スライサーおよびUV光で15分間すべての解剖器具を滅菌する。 シックスウェルTCプレートを準備します。各ウェ?…

Discussion

このメソッドは、 最初のStoppini の方法に基づいて11および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。

異なる血清源は、スライスの品質に…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NINDSによって賄われていた – NIH R01NS060756を

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cell culture inserts   Millipore PICM03050  
6 well plates   BD Falcon 353046  
Tissue Slicer   Stoelting 51425/51415  
Microscope   Olympus SZX7-ILLD2-100  
Hippocampus dissecting tool   F.S.T 10099-15  
Large utility scissors. Perfection   F.S.T 37500-00/37000-00 Right/ Left handed  
Iris Spatula   F.S.T 10093-13  
Straight spatula   F.S.T 10094-13  
Rounded spoon micro spatula   VWR 57949-039  
Dissecting single cutting edge needle   Electron Microscopy Science 72946  
Dissecting tweezers   Dummont #2  
Small dissecting scissors   F.S.T 14060-10  
MEM Eagle medium   Cellgro 50-019 PB  
Horse serum heat inactivated   Invitrogen 26050-88  
L-Glutamine (200 mM)   Invitrogen 25030081  
CaCl2 (1 M)   Sigma C3881  
MgSO4 (1 M)   Sigma M2773  
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N   Sigma I0516  
Ascorbic Acid, solution (25%)   Sigma A4544  
D-Glucose   Sigma G5767  
NaHCO3   Sigma S6014  
Hepes   Sigma H7523  
Sucrose   Sigma S5016  
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS   Sigma P0290  
KCl   Sigma P3911  
MgCl2 (1 M)   Sigma M9272  

References

  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
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  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

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Cite This Article
Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2462, doi:10.3791/2462 (2011).

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