Summary
Мы опишем способ получения органотипической срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Мозг ломтики укладываются на пористые мембраны и культура СМИ позволили сформировать интерфейс. Этот метод сохраняет валового архитектуры гиппокампа на срок до 2-х недель в культуре.
Abstract
Гиппокампе, компонент лимбической системы, играет важную роль в долговременной памяти и пространственной навигации 1. Нейронов гиппокампа может изменять силу своих связей после коротких периодов сильной активации. Это явление, известное как долгосрочные потенцирования (LTP) может длиться в течение нескольких часов или дней и стал лучшим кандидатом механизм обучения и памяти 2. Кроме того, четко определены анатомии и связи гиппокампа 3 сделал классической модельной системой для изучения синаптической передачи и синаптической пластичности 4.
Как наше понимание физиологии гиппокампа синапсов вырос и молекулярных игроков стал отождествляться, должны манипулировать синаптические белки стало императивом. Органотипической гиппокампа культур дают возможность для облегчения работы генов и точное фармакологического вмешательства, но сохранить синаптических организация, которая имеет решающее значение для понимания синапсов функционировать в более натуралистическом контексте, чем обычный культуре диссоциированных методы нейронов.
Здесь мы представляем метод для подготовки и культуры срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Этот метод позволяет легко добраться до срезы для генетических манипуляций, используя различные подходы, такие как вирусная инфекция или 5,6 biolistics 7. Кроме того, ломтики может быть легко восстановлено для биохимических анализов 8, или переведены на микроскопы для работы с изображениями 9 или электрофизиологических экспериментов 10.
Protocol
1. Перед началом Подготовка срезах гиппокампа.
- Подготовка ткани слайсер, размещая часть листа тефлона и монтаж нового лезвия.
- Протрите культуре ткани (ТС) капюшон с 70% этанола и установить рассекает микроскопом внутри. Стерилизовать капот, микроскоп, ткани резки и все рассекающих инструментов в течение 15 минут с УФ-светом.
- Подготовка шесть хорошо пластин ТК. Добавить 750 мкл часть питательных сред (SCM) в каждую лунку и место вставки культуре клеток в каждой лунке. Убедитесь, что мембраны тщательно мокрые, без пузырьков внутри. Место пластин в инкубаторе при температуре 35 ° C газом с 5% CO 2, пока это необходимо.
- Налейте 50 мл низкой Na + ACSF (рассечение раствора) в 100 мл стакан и положите его на льду-солевой смесью. Bubble низкой Na + ACSF с 5% CO 2 / 95% O 2 до изменения цвета и формы ACSF суспензии смесь замороженных и жидкого раствора (10-20 мин).
- Получить P5-P7 крысят. До трех щенков могут быть использованы.
2. Гиппокампа Подготовка Slices.
- Вырезать голова животного с острыми ножницами полезности. Разрежьте кожу и выставить череп. Откройте череп, сокращая из стороны в сторону вдоль interaural линии, а затем вдоль стреловидного шва с небольшими ножницами. Дополнительно вырезать из стороны в сторону в передней можно сделать для облегчения удаления костей и экспозиции головного мозга. Совок из мозга быстро с округлыми ложку микро шпателем и поместить его в суспензию рассекает решение для охлаждения в течение ~ 1 минуты. Налейте ~ 10 мл ледяной рассекает раствор на 60 мм блюдо и передачи мозг от стакана к блюду. Мозг должен быть покрыт рассекает решение.
- Под микроскопом рассекает: Место мозг и держать его на средней линии с рассекает щипцы прижат к нижней части 60 мм блюдо. Используйте гиппокампе рассекает инструмент для разделения полушарий выходя из среднего мозга. Гиппокампе которые затем выставляются на каждом полушарии. Затем осторожно совок гиппокамп с гиппокампе рассекает инструмент. Используйте рассекает иглу, чтобы полностью изолировать гиппокампе и почистите его как можно больше.
- Использование отрезал кончик P1000 кончика пипетки фильтр, мягко аспирата гиппокампе и перенести его на лист тефлоновой ткани на срез. Позиция гиппокампа на вогнутой стороне.
- Совместите перпендикулярно гиппокампе, чтобы лезвие, чтобы получить корональные разделы и слейте избыток жидкости.
- Нарежьте гиппокампе через каждые 400 мкм.
- Налейте ~ 10 мл холодного SCM в 60 мм блюдо и передачи нарезанный гиппокампе от резки с использованием другого отрезал P1000 Фильтр наконечника и холодного SCM. Избегайте пузырей.
- С помощью шпателя радужной оболочкой и прямой шпатель мягко отдельных ломтиков друг от друга.
- Отдельные четко определены и неповрежденной ломтики с поврежденных ломтиками.
3. Гиппокампа культуры Ломтики
- Принесите шесть-луночных планшетах с СКМ и вставляет культуре клеток из инкубатора. С помощью другого отрезал P1000 Фильтр наконечника, передача отдельных ломтиков на мембране. Место 4-5 ломтика в мембране. Будьте осторожны, чтобы не место ломтики либо близко к стене или вставить близко друг к другу. При необходимости использовать диафрагму лопаточку, чтобы отдельные кусочки. Удалите излишки среды. Сенсорный ломтиками как можно меньше, когда они находятся на мембране.
- Перемещение пластины обратно в инкубатор и культуры при 35 ° С и 5% СО 2.
- Изменение СКМ каждые 48 часов внутри капота ТС на аспирационных СКМ с пипетки Пастера. Добавить 750 мкл свежего подогретого СКМ на лунку. Убедитесь в отсутствии пузырьков образуются под мембраной.
4. Решения
- Низкий Na + ACSF - Пройдя Решение для срез культуры
Для деионизированной и стерильные H 2 O добавить:На 500 мл За 1000 мл Конечная концентрация CaCl 2 (1 М) 0,5 мл 1 мл 1 мМ D-глюкозы 0,901 г 1,802 г 10 мМ KCl 0,149 г 0,298 г 4 мМ MgCl 2 (1 М) 2,5 мл 5 мл 5 мМ NaHCO 3 1,092 г 2,184 г 26 мм Сахароза 40 г 80 г 234 мм Фенол красный раствор 0,5% в DPBS 0,5 мл 1 мл 0,1% об. /
Смешайте ~ 30 мин
SterilИзе пропусканием через 0.22μm фильтр
Сделайте 50 мл аликвоты и хранить при 4 ° С не более 2 месяцев. - Фрагмент культуральной среде (SCM)
На 500 мл За 1000 мл Конечная концентрация MEM Eagle среда 4,2 г 8,4 г 8,4 г / л Лошадиной сыворотки тепла инактивированной 100 мл 200 мл 20% L-глютамин (200 мм) 2,5 мл 5 мл 1 мМ CaCl 2 (1 М) 0,5 мл 1 мл 1 мМ MgSO 4 (1 М) 1 мл 2 мл 2 мМ Инсулин (1 мг / мл), растворенный в 0,01 н HCl 0,5 мл 1 мл 1 мг / л Аскорбиновая кислота, раствор (25% вес / объем) 0,024 мл 0,048 мл 0,00125% D-глюкозы 1.16g 2.32g 13 мм NaHCO 3 0.22g 0.44g 5,2 мм Hepes 3.58g 7.16g 30 мМ
Смешайте пока полностью не растворяется и довести до комнатной температуры.
Отрегулируйте рН до 7.27-7.28 с 1 N NaOH
Мера осмолярности. Отрегулируйте до 320 ммоль / кг деионизированной и стерилизовать H 2 O. Ожидать, чтобы добавить примерно 25-40 мл. Проверьте осмолярность снова.
*** РН может немного измениться во время настройки осмолярность, это нормально, это более важно, что осмолярность находится в правильном диапазоне (317-323).
Стерилизовать прохождения через фильтр 0,22 мкм.
Сделайте 20 мл аликвоты и хранить в течение двух-трех недель при температуре 4 ° C.
Gluatamine складе: подготовить в концентрации 200 мМ и хранить при температуре -20 ° С в аликвоты 2,5 мл.
Акции Аскорбиновая кислота: подготовить в концентрации 25% (м / о) и хранили при -20 ° С в аликвоты 100 мкл.
5. Представитель Результаты:
Ломтики должны выглядеть белой под рассекает сферу без черных пятен и четко определены и неповрежденной CA1, СА3 и зубчатой извилине регионах. Бактериальное загрязнение легко видеть, как движущиеся черные точки в средне-и мутность СКМ. При помещении под микроскопом, поверхность среза должна выглядеть чистым после 4 дней в культуре с четкими и ощутимо органами клетки. Если нет четкого органов ячейки видел и много мусора покрывает поверхность после 4 дней, то это не здоровое срез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод основан на методе, впервые описанный Stoppini и соавт. 11 и предлагает быстрый способ к культуре срезах гиппокампа. Наиболее важным аспектом этого протокола заключается в поддержании ломтиками стерильной, поэтому очень важно использовать соответствующие методы и стерильные правильно дезинфицировать и стерилизовать все материалы, в контакте с тканью.
Различные источники сыворотки может влиять на качество ломтиками. Мы рекомендуем проверить несколько партий в первую очередь. Если загрязнение повторяющаяся проблема, проверьте инкубатора и культуры тканей капот возможных источников загрязнения. Правильное использование стерильных методы в течение всей процедуры является существенным.
Общее время от обезглавливания размещению ломтики на мембране и в инкубаторе должна быть не более 1,5 часов. Если процедура занимает слишком много времени, это поставит под угрозу здоровье ломтиками.
Размещение ломтики на пористую мембрану гарантий надлежащего оксигенации и питания через тонкий слой СКМ, которая формируется капиллярности. Этот метод может быть адаптирован для других областей мозга, при условии, что плотность ткани позволяет правильно кислородом и питательными проникновения. Таким образом, плотность ткани пределы этого метода для молодых тканей. Для гиппокампе, ломтики 300-400 мкм из-p6 p7 животных, кажется, дают лучшие результаты. Этот тип срезов может быстро получить с тканью слайсер уменьшения времени ткань подвергается воздействию воздуха.
Важно для тех, изучения синаптической физиологию, через несколько дней в культуре, все мусор из мертвых клеток была удалена, оставляя чистую поверхность отлично подходит для электрофизиологических или изображений экспериментов. Кроме того, органотипической срезах гиппокампа продолжать развивать нормальные связи сравнима с острой ломтиками 12. Однако через 2 недели в культуре этого нормального подключения исчезает, как нейроны начинают формировать слишком много соединений, что увеличивает синаптической активности в срезе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F.
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
