用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Summary

ドリップ流反応器と回転するディスクの原子炉とオープンシステムの流れのバイオフィルムを利用するためのプロトコルを詳細に表示されます。

Abstract

自然の中で最も微生物が¹細菌のバイオフィルムは、マトリックス内に収められています。バイオフィルムの表面に関連したコミュニティとして存在すると考えられ、表面²バイオフィルム形成と発展に添付されるかは、一般的にこのようなマイクロタイタープレートやフローなどのバッチシステムを使用して実験室で検討されていますこのようなフローセルなどのシステム、。これらの手法は、可視化（フローセル^）4の（マイクロタイタープレート^）3または成長するバイオフィルムの変異体、化学ライブラリーをスクリーニングするのに便利です。ドリップフローバイオリアクターと回転するディスクのバイオリアクター：ここでは、フローシステムのバイオフィルムの追加の2種類で成長している黄色ブドウ球菌の詳細なプロトコールを提示する。

ドリップフローバイオリアクターは、低剪断条件下で栽培したバイオフィルムの研究のために設計されています^。5ドリップ流反応器は、4つの並列テストチャネル、一つの標準ガラスの顕微鏡スライドサイズのクーポンを持ってそれぞれの能力、またはカテーテルまたはスティントの長さで構成されています。ドリップ流反応器はマイクロセンサのモニタリング、一般的なバイオ研究、バイオフィルムcryosectioningサンプル、高いバイオマス生産、医療材料の評価、および留置医療機器のテストに最適です^{。6,7,8,9は}

回転するディスクの原子炉は、取り外し可能なクーポンのための凹部を含むテフロンディスクで構成されています^。10リムーバブルクーポンは、任意の被削材から作らできます。回転ディスクの底面は、ディスクの回転が表面フラッシュクーポンを越え液体表面のせん断を作成できるように棒磁石が含まれています。 18クーポンを含むディスク全体を1000mLのガラスサイドアームの原子炉容器内に配置されます。ディスクは、マグネチックスターラーで回転させながら液体増殖培地は、血管を通して循環される。クーポンは、原子炉容器から除去し、さらに研究や顕微鏡イメージングのためのバイオフィルムのサンプルを収集するようにこすりされています。回転するディスクの原子炉は、殺生物剤の有効性、バイオフィルムの除去、及び防汚材料の性能の実験評価用に設計されています^{。9,11,12,13}

Protocol

1。ドリップフローバイオフィルムリアクター

1. ドリップフローバイオリアクターが組み立てとオートクレーブされた（Biosurface技術またはカスタム設計されたバージョンから利用可能な通常の大学のマシンのお店で作ることができる、図1を参照してください）​​。アセンブリは、チャンバーと確保室の蓋に貼るクーポンを伴います。バイオフィルム培地（トリプシン大豆ブロス2グラム/ Lとグルコース2グラム/ L）、および流入栄養チューブと一緒にチャンバーは、オートクレーブによって滅菌されています。
2. ドリップフローリアクターの接種は、平らな面に原子炉を配置排水配管ラインをクランプ、10 mLのトリプシン大豆ブロスでそれぞれのチャンバーに充填し、S.の10μLを加えることによって予備成形され黄色ブドウ球菌の培養には、トリプシン大豆ブロス中で一晩増殖。接種した原子炉は、18時間、37℃インキュベーター内の場所です。
3. インキュベーションの18時間後、排水チューブがアンクランプされ、反応器は10 °の角度にカット木のブロックに配置されます。
4. 無菌的に連続的なフロー栄養ブロスを含む瓶に流入栄養チューブを接続してください。最大速度（ポンプのモデルによって異なります）でポンプを実行することにより、ポンプやプライムチューブを介してチューブラインを通します。
5. 一度流入管は、ポンプを停止し、各チューブの端に接続針（22ゲージ、1インチ）を取り付ける準備され。エタノールワイプと無菌的に口栓に針を挿入するとチャンバーの入口ストッパーを拭きます。
6. ポンプの電源を入れ、クーポンを介して（流量〜125μL/分）メディアは徐々に滴下することができます。メディアは入口ストッパーのポートからの排水ポートにクーポンに沿って下方に流れる必要があります。時折、適切な排水のために原子炉をチェックし、2〜5日（アプリケーションに応じて）連続的な流れで原子炉を操作してください。
7. ドリップ流反応器のバイオフィルムを回収するために、ポンプを停止し、慎重に反応器から針を取り除く。次いで反応器を平らな面に置くことができ、クーポンを無菌的に滅菌ピンセットを使用して削除することができます。顕微鏡が必要な場合は、クーポンが今それに応じて処理することができる（図2Bは、ドリップのバイオリアクターで成長させた黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真である）。バイオフィルムのバイオマスや生理学の研究の定量化は、研究の目的である場合、バイオフィルムは、セルスクレーパーを使用してクーポンから削除することができます。鉗子でクーポンを押しながら、静かにセルスクレイパーを用いてリン酸緩衝生理食塩水を含むコニカルチューブにクーポンからバイオフィルムをこすり落とす。注：バイオフィルムのコロニー形成単位を定量化するためには、それは、塊を分解し、均一な懸濁液を形成するために組織ホモジナイザーで収穫されたバイオフィルムを均一にする必要があります。組織ホモジナイザーの様々なモデルがこのアプリケーションに適しています。我々は、バイオフィルム試料を均質化するため1分間、フルスピードでフィッシャーサイエンティフィックTissuemiserホモジナイザー（製品＃15-338-420）を利用。バイオフィルムを均一に失敗すると、サンプル中に存在するコロニー形成単位の過小評価になります。

2。回転円板のバイオフィルムリアクター

1. 回転ディスクのバイオリアクターは（作られた、図3を参照Biosurface Technologies社から入手できるから入手するか、カスタムすることができます）組み立てとオートクレーブされている。回転するディスクのスロットに最初の場所で回転するディスクのクーポンをリアクタを組み立て、オーバーフローのポートを備えた1リットルのガラスビーカーに置きます。メディアフローと曝気を許可するようにあけられた穴を持つ数15ゴム栓は、原子炉のキャップとして使用されます。リアクター、バイオフィルムメディア（トリプシン大豆ブロスを2g / L、グルコース2g / Lの）、およびインレットチューブはその後オートクレーブによって滅菌されています。
2. 回転ディスクのバイオリアクターは、リアクターに無菌培地250 MLSを配置することにより接種し、一晩S.の0.5 mLを加えている黄色ブドウ球菌の培養には、トリプシン大豆ブロス中で増殖させた。次いで反応器を250回転に設定されて撹拌プレート上に配置し、所望の温度で一晩インキュベートする。
3. インキュベーションの16時間は、メディアタンクのポートにインレットチューブを接続し、蠕動ポンプに接続した後。ポンプは、システムの電源をオンにします。されて​​おり、流れは〜0.25 mL /分（フローが望ま成長率に応じて変更可能）に設定します。
4. 24時間後に原子炉を停止し、無菌的にバイオフィルムのクーポンを触れることなく、ディスクを取り出します。滅菌ピンセットを使ってクーポンを削除し、リン酸にそれぞれを浸すにはどんな緩く付着細菌を除去するために緩衝生理食塩水。
5. 抗菌性化合物のテストのために、チップは、関心のある化合物を含有する96ウェルプレートの個々のウェルに配置することができます。インキュベーション後、チップを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水を含む1.5 mlのマイクロチューブに移し、そのままバイオフィルムを分散させるためにホモジナイザー組織でホモジナイズ。
6. 次いで、細胞をシリアル希釈し、実行可能なコロニーformiを決定するために栄養寒天培地上にプレーティングされていますngの単位。
7. 注：多くの変化が上記のプロトコルで行うことができます。有効性をテストする例については、回転するディスクのクーポンをコーティングすることができるまたは潜在的な抗バイオフィルムの化合物から作ら。バイオフィルムの分散剤は、分散剤の化合物と接続されている対切り離さ定量化する細菌のクーポンをインキュベートすることを評価することができる。

3。代表的な結果

ドリップ流反応器までセットの例を図1の場合は示されています。流れの三日後にバイオフィルムのおびただしい量は、クーポンの表面に図2Aを蓄積することになります。総バイオマスは菌株と正確な成長条件によって異なります。 S.の走査型電子顕微鏡写真ドリップフロー反応器内で栽培ブドウ球菌のバイオフィルムは、図2Bに示されています。

回転するディスクの原子炉は、図3Aに示されています。記述されたプロトコルは、バイオフィルムを形成することが可能な一般に任意の微生物の特定の要件に適合させることができます。図3Bは、18プラスチック製のディスクが添付さで回転するディスクを示しています。これらのディスクに成長したバイオフィルムは、特に抗菌性試験に適しており、再現性の高い結果が^11を得ています。

図1。ドリップ流反応器のセットアップ。重要なコンポーネントが表示されています。

図2。ドリップフローの例S.黄色ブドウ球菌のバイオフィルム。 A）このバイオフィルムは、記述されているプロトコルは、次の三日間成長させた。原子炉の最初の二つのチャンバーからのふたは黄色S.を表示するために削除されます。 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムのバイオマス。 S.のB）Sacnning電子顕微鏡写真黄色ブドウ球菌のバイオフィルムは、ドリップフロー反応器内で栽培。

図3。回転ディスク型原子炉。 A）実行されている回転ディスクの原子炉の例。キーコンポーネントが表示されています。 B）回転するディスクのビューをクローズアップ。

Discussion

別の炉で成長させたバイオフィルムは、多くの異なる特性を持つことになりますし、各反応器は、異なるアプリケーションを持っています。ドリップフローバイオリアクターと回転ディスク型原子炉：この作品では、我々は2つ​​のバイオフィルムリアクターの使用を説明しています。フロー炉ドリップ空気 - 液体界面での低せん断バイオフィルムを成長させるために有用であり、様々な条件に適応可能です。我々は、バイオフィルムのバイオマスの大規模な量が望ましいの研究のためにそれらは非常に便利です。このセットアップは、簡単にマイクロセンサ監視し、潜在的なantibiofilm面のテストを対象とした研究に適応することができます。

回転するディスクの原子炉は、中程度のせん断環境下でディスクを取り外すに複数の同一のバイオフィルムを成長させるために便利です。リムーバブルディスク上に複数の同一のバイオフィルムを生成するためにこの原子炉の能力は、抗菌性化合物およびバイオフィルム抵抗力面のテストを対象とした研究に最適です。これらのバイオリアクターを使用して、研究者が最適なモデル、その特定の研究ニーズをするプロトコルを変更することが奨励されているときに多くのアプリケーションが可能です。

これらのプロトコルは、フローセルと、過去に多くの広範囲に使用されている静的なアッセイのバイオフィルムへの代替手段を提供します。彼らはまた、多様な臨床感染症を模倣するより大きな能力を提供することがあります。しかし、各手法の潜在的な制限があります。例えば、防滴流反応器と回転するディスクの原子炉は、共焦点顕微鏡によるバイオフィルムの可視化に理想的なものではありません。また、原子炉の種類で栽培バイオフィルムの生理学は、おそらく大幅に異なります。例えば、防滴流の原子炉は、フローセルのバイオフィルム全体の栄養培地の均一な層流と非常に異なっている深刻な栄養素勾配を露出されているバイオフィルム、になります。最終的には、利用バイオリアクターの種類は、問題が対処さに左右され、捜査官は、複数のバイオリアクターシステムはそれらの研究のために利用可能であることに注意する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation