ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Protocolos para a utilização de biofilmes fluxo de abrir o sistema com reatores de fluxo de gotejamento e girando reatores disco são apresentadas em detalhe.
Abstract
A maioria dos micróbios na natureza são pensados para existir como superfície associados comunidades em biofilmes. Um biofilme bacteriano são encerradas dentro de uma matriz e anexado a uma superfície de formação de biofilmes. 2 e desenvolvimento são comumente estudados em laboratório, utilizando sistemas de lote, tais como placas de microtitulação ou fluxo sistemas, tais como o fluxo de células. Estas metodologias são úteis para triagem bibliotecas mutante e química (placas de microtitulação) 3 ou crescente biofilmes para visualização (células de fluxo) 4. Aqui apresentamos protocolos detalhados para Staphylococcus aureus crescendo em dois tipos adicionais de biofilmes sistema de fluxo: o gotejamento reator biofilme fluxo e reator de biofilme rotação do disco.
Reatores de gotejamento biofilme de fluxo são projetados para o estudo de biofilmes cultivados sob condições de cisalhamento baixa. 5 O reator de fluxo de gotejamento consiste em quatro canais de teste em paralelo, cada um capaz de manter um padrão de vidro cupom lâmina de microscópio de tamanho, ou um comprimento de cateter ou stint. O reator de fluxo de gotejamento é ideal para monitoramento microsensor, estudos gerais biofilme, as amostras de biofilme cryosectioning, alta produção de biomassa, as avaliações material médico e teste de dispositivo de habitação médica. 6,7,8,9
O reator de disco giratório consiste em um disco de teflon contêm recessos para cupons removível. 10 Os cupons podem removível pelo feito de qualquer material usinável. A parte inferior do disco rotativo contém um ímã de barra para permitir a rotação de disco de corte para criar superfície do líquido sobre a superfície de descarga cupons. Todo o disco contendo 18 cupons é colocado em um copo mL mil vaso do reator lado-braço. Um meio de crescimento líquido é circulado através do navio enquanto o disco é girado por um agitador magnético. Os cupons são removidos do reator e, em seguida, raspado para coletar a amostra de biofilme para estudos adicionais ou imagens de microscopia. Reatores disco rotativo são projetados para avaliações laboratoriais de eficácia biocida, a remoção do biofilme eo desempenho do anti-incrustantes materiais. 9,11,12,13
Protocol
1. O gotejamento Reactor Biofilm Fluxo
- O reator de biofilme fluxo de gotejamento (disponível a partir Technologies Biosurface ou personalizado versões projetadas geralmente pode ser feita por oficinas de mecânica da universidade, ver Figura 1) é montado e autoclavada. Assembléia envolve cupons aposição em câmaras e as tampas de câmara de segurança. A câmara, juntamente com o meio biofilme (caldo tripticase soja 2 gramas / L e glicose de 2 gramas / L), e tubos de nutrientes influentes são esterilizados em autoclave.
- Inoculação do reator de fluxo de gotejamento é pré-formado, colocando o reator em uma superfície plana, de fixação das linhas de tubulação de efluentes, preenchendo cada uma das câmaras com 10 mL de caldo de soja tríptica e adicionando 10 mL de um S. cultura aureus cresceu durante a noite em caldo tripticase soja. O reator é inoculado em seguida, coloque em uma incubadora de 37 ° C por 18 horas.
- Após 18 horas de incubação, o tubo efluente é despinçada eo reator é colocado em um bloco de madeira cortada a um ângulo de 10 °.
- Assepticamente conectar a tubulação influentes de nutrientes para o frasco contendo o caldo nutriente fluxo contínuo. Alimentar a linha de tubos através da bomba e os tubos principais, executando a bomba a uma velocidade máxima (irá variar dependendo do modelo da bomba).
- Uma vez que a tubulação afluente está preparado parar a bomba e anexar agulhas connect (calibre 22, 1 polegada) ao final de cada tubo. Limpe a tampa de entrada de câmara com uma limpeza e assepsia do etanol inserir as agulhas através da rolha de entrada.
- Ligue a bomba e deixe que a mídia lentamente por gotejamento (taxa de fluxo de ~ 125 mL / minuto) ao longo dos cupons. A mídia deveria fluxo descendente ao longo do vale do porto rolha de entrada para o porto de efluentes. Operar o reator em fluxo contínuo por 2-5 dias (dependendo da aplicação), ocasionalmente verificar o reator para a drenagem adequada.
- Para colher o gotejamento biofilmes reator de fluxo, parar a bomba e remova cuidadosamente as agulhas do reator. O reator pode ser colocado sobre uma superfície plana e os cupons podem ser assepticamente removidos com pinças estéreis. Se microscopia é desejado, os cupons podem ser processados em conformidade (Figura 2B é uma micrografia eletrônica de varredura de um biofilme de S. aureus cresceu em um reator de biofilme por gotejamento). Se a quantificação da biomassa do biofilme ou estudos de fisiologia são o objetivo do estudo, o biofilme pode ser removida do cupom usando um raspador de celular. Enquanto mantém os cupons com uma pinça, raspe o biofilme off o cupom em um tubo cônico contendo tampão fosfato salino com uma espátula celular. Nota: para quantificar a unidades formadoras de colônias nos biofilmes, é necessário homogeneizar os biofilmes colhida com um lenço de papel homogeneizador para desagregar aglomerados e formar uma suspensão homogênea. Vários modelos de homogeneizadores de tecidos são adequados para esta aplicação. Nós utilizamos um Fisher Scientific Tissuemiser Homogeneizador (produto # 15-338-420) em velocidade máxima durante 1 minuto para homogeneizar as amostras de biofilme. Falta de homogeneizar o biofilme irá resultar em uma subestimação da unidades formadoras de colônias presentes na amostra.
2. O Reactor Biofilm Rotating Disk
- O reator de biofilme rotação do disco (disponível disponível a partir Technologies Biosurface ou podem ser feitos, veja a Figura 3) é montado e autoclavada. Montar o reator por primeiro lugar a fiação cupons disco nas ranhuras do disco de fiação e colocá-lo em uma proveta de vidro de 1 litro com uma porta de overflow. A número 15 de borracha rolha com furos nele para permitir o fluxo de mídia e aeração é usado como a tampa do reator. O reator, biofilme media (caldo tripticase soja 2 g / L e glicose 2 g / L), e tubulação de entrada são, então, esterilizados em autoclave.
- O reator de biofilme rotação do disco é inoculada, colocando 250 mL de meio estéril para o reator, e adicionando 0,5 mL de uma noite de S. cultura aureus cultivadas em caldo tripticase soja. O reator é então colocado em uma placa de agitação ajustado para 250 rpm e incubados durante a noite na temperatura desejada.
- Após 16 horas de incubação conectar a tubulação de entrada para a porta no reservatório de médio e conectá-lo à bomba peristáltica. A bomba é, então, ligar e fluxo definido como ~ 0,25 mL / min (fluxo pode ser alterada dependendo da taxa de crescimento desejado).
- Depois de 24 horas parada do reator e assepticamente remover o disco, sem tocar os cupons biofilme. Remove os cupons usando uma pinça estéril e mergulhe cada um em tampão fosfato salina para remover qualquer bactéria fracamente ligados.
- Para os testes de compostos antimicrobianos, os chips podem ser colocados em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo compostos de interesse. Após a incubação, os chips são transferidos para tubos de 1,5 mL de microcentrífuga contendo 1 mL de tampão fosfato salina e homogeneizado com um lenço de papel homogeneizador para dispersar o biofilme intacta.
- Células são então diluídas em série e semeados em ágar nutriente para determinar viável colônia formiunidades ng.
- Nota: muitas variações podem ser feitas no protocolo acima. Por exemplo, disco giratório cupons podem ser revestidos com ou feito de potenciais compostos anti-biofilme para testar a eficácia. Dispersantes biofilme pode ser avaliada também estar a incubar cupons em compostos dispersantes e bactérias quantificar anexado contra destacados.
3. Resultados representante
Um exemplo de um conjunto de reator de fluxo de gotejamento é mostrado se a Figura 1. Após três dias de fluxo de grandes quantidades de biofilme se acumulam na superfície do cupom, Figura 2A. A biomassa total irá variar de acordo com cepas bacterianas e condições de crescimento precisa. A micrografia eletrônica de varredura de um S. biofilme aureus cresceu no reator de fluxo de gotejamento é mostrado na Figura 2B.
Um reator de disco rotativo é mostrado na figura 3A. O protocolo descrito podem ser adaptados às necessidades específicas de qualquer microorganismo geralmente capaz de formar um biofilme. Figura 3B mostra o disco giratório com 18 discos de plástico aposta. Estes biofilmes disco-grown são particularmente bem adaptado para testes antimicrobianos e produzir resultados altamente reprodutíveis 11.
Figura 1. Gotejamento configuração do reator de fluxo. Componentes importantes são rotulados.
Figura 2. Exemplo de um fluxo de gotejamento S. biofilme aureus. A) O biofilme foi cultivado por três dias após o protocolo descrito. Tampas das duas primeiras câmaras do reator são removidos para mostrar a S. amarela biomassa biofilme aureus. B) Sacnning micrografia eletrônica de um S. biofilme aureus cresceu no reator de fluxo de gotejamento.
Figura 3. O reator disco rotativo. A) Exemplo de um reator de disco executando spinning. Componente-chave são rotulados. B) Feche acima da vista de um disco giratório.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofilmes cultivados em reatores diferentes, muitas vezes, têm características diferentes e cada reator tem aplicações diferentes. Neste trabalho, descrevemos a utilização de dois reatores de biofilme: um reator de biofilme por gotejamento e um reator de fluxo de disco rotativo. Reatores de fluxo de gotejamento são úteis para o crescimento de biofilmes baixo cisalhamento de uma interface ar-líquido e são adaptáveis a uma variedade de condições. Encontramo-las extremamente conveniente para estudos, onde uma grande quantidade de biomassa do biofilme é desejável. Esta configuração pode ser facilmente adaptado para estudos envolvendo monitoramento microsensor e os testes de superfícies antibiofilme potencial.
O reator de disco rotativo é útil para o crescimento de biofilme em discos múltiplos idênticos remover sob um ambiente de cisalhamento moderados. A capacidade deste reator para produzir múltiplas biofilmes idênticos em discos removíveis o torna ideal para estudos envolvendo o teste de compostos antimicrobianos e superfícies resistentes biofilme. Muitas aplicações são possíveis quando se utiliza estes reatores de biofilme e pesquisadores são encorajados a modificar o protocolo para melhor modelo às suas necessidades de investigação específicos.
Esses protocolos fornecem alternativas para a célula de fluxo e estática biofilmes ensaios que têm sido utilizados mais extensivamente no passado. Eles também podem fornecer uma maior capacidade de imitar diversos infecções clínicas. No entanto, existem limitações em potencial com cada técnica. Por exemplo, os reatores de gotejamento de fluxo e reatores disco rotativo não são ideais para a visualização de biofilmes por microscopia confocal. Além disso, a fisiologia de biofilmes cultivados em diferentes tipos de reatores provavelmente vai variar muito. Por exemplo, o reator de fluxo de gotejamento resultará em um biofilme sendo expostas graves gradientes de nutrientes, que é muito diferente do fluxo laminar de nutrientes uniforme de mídia através de um biofilme célula de fluxo. Em última análise, o tipo de reator de biofilme utilizada vai depender das questões a ser abordadas e os investigadores devem estar cientes de que vários sistemas de reactores de biofilme estão disponíveis para seus estudos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
NIAID conceder K22AI081748.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drip Flow Reactors | BioSurface Technologies Corporation | DFR 110 | |
| Rotating Disk Reactors | BioSurface Technologies Corporation |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial Biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. Bacterial biofilms in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).
- Boles, B. R., Horswill, A. H. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).
- Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).
- Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).
- Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology. 146, 547-549 (2000).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).
- Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms. J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).
- Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).
- Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).
Tags
Imunologia Edição 46 biofilme o reator de fluxo de gotejamento reator de disco rotativo biofilme sistema abertoErratum
Formal Correction: Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
A correction was made to The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis. There was an error with an author's name. The author's middle initial was missing, this was corrected to:
Blaise R. Boles
instead of:
Blaise Boles.
