Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Summary

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Abstract

De meeste microben in de natuur worden verondersteld te bestaan ​​als oppervlakte-geassocieerde gemeenschappen in biofilms. Bacteriële biofilms ^een zijn gevat in een matrix en gehecht aan een oppervlak. ^Twee biofilm vorming en ontwikkeling worden vaak onderzocht in het laboratorium met behulp van batch-systemen zoals microtiterplaten of stroom systemen, zoals flow-cellen. Deze methoden zijn bruikbaar voor het screenen mutant en chemische bibliotheken (microtiterplaten) ³ of groeiende biofilms voor visualisatie (flow-cellen) ^4. Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor de teelt van Staphylococcus aureus in de twee andere soorten van flow systeem biofilms: het infuus stroom biofilm reactor en de roterende schijf biofilm reactor.

Drip stroom biofilm reactoren zijn ontworpen voor de studie van biofilms gegroeid onder lage afschuiving omstandigheden. ⁵ De drip flow reactor bestaat uit vier parallelle test kanalen, die elk kunnen houden een standaard glas microscoopglaasje grote coupon, of een lengte van katheter of stint. Het infuus flow reactor is ideaal voor microsensor monitoring, algemeen biofilm studies, biofilm cryosectioning monsters, een hoge productie van biomassa, medisch materiaal evaluaties en inwoning medische apparatuur testen. ^6,7,8,9

De roterende schijf reactor bestaat uit een teflon schijf met uitsparingen voor uitneembare coupons. ¹⁰ De verwijderbare coupons kan door gemaakt van een machinaal materiaal. De onderkant van de draaiende schijf bevat een staafmagneet, zodat schijf draaien om vloeibare slijtvastheid van het oppervlak te creëren over het oppervlak-flush coupons. De hele schijf met 18 coupons is geplaatst in een 1000 ml glas side-arm reactorvat. Een vloeibaar groei media is verspreid via het vat, terwijl de schijf wordt gedraaid door een magnetische roerder. De coupons worden verwijderd uit het reactorvat en dan geschraapt om de biofilm monster te verzamelen voor verdere studie of microscopie beeldvorming. Draaiende schijf reactoren zijn ontworpen voor laboratorium evaluaties van biocide werkzaamheid, biofilm verwijdering, en de prestaties van anti-fouling materialen. ^9,11,12,13

Protocol

1. De Druppel Flow Biofilm Reactor

1. Het infuus stroom biofilm reactor (verkrijgbaar bij Biosurface Technologies of op maat gemaakte versies kunnen meestal worden gedaan door de universiteit machine winkels, zie figuur 1) is gemonteerd en geautoclaveerd. Vergadering gaat om het aanbrengen van coupons in kamers en het veiligstellen van kamer deksels. De kamer, samen met biofilm medium (tryptische soja-bouillon 2 gram / L en glucose 2 gram / L) en de invloedrijke voedingsstoffen buizen worden in de autoclaaf.
2. Enten van het infuus stroming reactor is voorgevormd door het plaatsen van de reactor op een vlakke ondergrond, klem het effluent buis lijnen, het vullen van elke kamer met 10 ml tryptische soja bouillon en het toevoegen van 10 pi van een S. aureus cultuur 's nachts gegroeid in tryptische soja bouillon. De geïnoculeerde reactor wordt vervolgens plaats in een 37 ° C incubator gedurende 18 uur.
3. Na 18 uur incubatie, is het effluent buizen ontspannen is en de reactor wordt geplaatst op een houten blok gesneden een 10 ° hoek.
4. Aseptisch sluit de influent voedingsstoffen slang aan op de fles met de continue stroom voedingsstoffen bouillon. Voer de slang lijn door de pomp en de eerste de buizen door het uitvoeren van de pomp met een maximale snelheid (afhankelijk van model pomp).
5. Zodra het influent slang gevuld stopt de pomp en hechten sluit naalden (22 gauge, 1 inch) aan het einde van elke buis. Veeg de kamer inlaat stop met een veeg ethanol en aseptisch de naalden te voegen via de inlaat stop.
6. Zet de pomp en laat de media langzaam te druppelen (debiet ~ 125 pL / minuut) over de coupons. De media moet neerwaartse stroming langs de coupon van de inlaat stop-poort aan de effluent-poort. Bedien de reactor in continue stroom voor 2-5 dagen (afhankelijk van de toepassing), af en toe controleren van de reactor voor een goede drainage.
7. Om de oogst het infuus stromingsreactor biofilms, stop de pomp en voorzichtig de naalden uit de reactor. De reactor kan dan worden geplaatst op een vlakke ondergrond en de bonnen kan aseptisch worden verwijderd met behulp van steriel pincet. Als microscopie is gewenst, de coupons kan nu dus worden verwerkt (Figuur 2B is een scanning electronen microscoop foto van een S. aureus biofilm gekweekt in een druppel biofilm reactor). Indien kwantificering van de biofilm biomassa of fysiologie studies zijn het doel van het onderzoek, kan de biofilm worden verwijderd uit de coupon behulp van een mobiele schraper. Terwijl u de coupons met een tang voorzichtig de biofilm af te schrapen van de coupon in een conische buis met fosfaat gebufferde zoutoplossing met behulp van een cel schraper. Let op: te kwantificeren van de kolonievormende eenheden in de biofilms, is het noodzakelijk om te homogeniseren het geoogste biofilms met een tissue homogenisator om klonten disaggregeren en een homogene suspensie te vormen. Verschillende modellen van weefsel homogenisatoren zijn geschikt voor deze toepassing. We maken gebruik van een Fisher Scientific Tissuemiser Homogenizer (product # 15-338-420) op volle snelheid gedurende 1 minuut tot biofilm monsters homogeniseren. Als de biofilm homogeniseren zal resulteren in een onderschatting van de kolonievormende eenheden in het monster aanwezig.

2. De draaiende schijf Biofilm Reactor

1. De roterende schijf biofilm reactor (beschikbaar vanaf die beschikbaar zijn vanaf Biosurface Technologies of kunnen op maat gemaakt, zie figuur 3) is gemonteerd en geautoclaveerd. Monteer de reactor door eerste plaats de draaiende schijf coupons in de sleuven van de draaiende schijf en te plaatsen in een 1-liter glazen beker met een overloop-poort. Een aantal 15-rubber stop met gaten geboord in het aan de media flow en beluchting toe wordt gebruikt als de reactor dop. De reactor, biofilm media (tryptische soja-bouillon 2 g / L en glucose 2 g / L), en inlaat slangen worden dan gesteriliseerd door autoclaaf.
2. De roterende schijf biofilm reactor wordt geënt door het plaatsen van 250 ml van steriel medium in de reactor, en het toevoegen van 0,5 ml van een overnachting S. aureus cultuur gekweekt in tryptische soja bouillon. De reactor wordt vervolgens geplaatst op een roer plaat ingesteld op 250 tpm en 's nachts geïncubeerd op de gewenste temperatuur.
3. Na 16 uur incubatie sluit de inlaat slang aan op de poort op de middellange reservoir en sluit deze aan op de peristaltische pomp. De pomp wordt dan ingeschakeld en de stroom ingesteld op ~ 0,25 ml / min (stroom kan worden gewijzigd afhankelijk van de gewenste groei).
4. Na 24 uur stoppen met de reactor en aseptisch de disk te verwijderen zonder het aanraken van de biofilm coupons. Verwijder de coupons met steriele pincet en duik ieder een in fosfaat gebufferde zoutoplossing aan een los bijgevoegde bacteriën te verwijderen.
5. Voor antimicrobiële stof testen, kan de chips worden geplaatst in afzonderlijke wells van een 96 wells plaat die verbindingen van belang. Na de incubatie zijn chips overgebracht naar 1,5 ml microcentrifugebuizen met 1 mL fosfaatbuffer zoutoplossing en gehomogeniseerd met een tissue homogenisator om de intacte biofilm verspreiden.
6. Cellen worden dan serieel verdund en uitgeplaat op voedingsagar medium om levensvatbare kolonie Formi te bepalenng eenheden.
7. Let op: vele variaties kunnen worden gemaakt op de bovenstaande protocol. Zo kan bijvoorbeeld draaiende schijf coupons worden bekleed met of gemaakt van potentiële anti-biofilm verbindingen om de werkzaamheid te testen. Biofilm dispergeermiddelen kan ook worden geëvalueerd worden incuberen coupons in dispergeermiddel verbindingen en kwantificeren van bacteriën bevestigd versus vrijstaand.

3. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een set-up infuus flow reactor wordt weergegeven als figuur 1. Na drie dagen van stroom overvloedig biofilm zal verzamelen op de coupon oppervlak, figuur 2A. De totale biomassa zal variëren afhankelijk van bacteriestammen en nauwkeurige groeiomstandigheden. Een scanning electronen microscoop van een S. aureus biofilm gegroeid in de drip stroming reactor is weergegeven in figuur 2B.

Een roterende schijf reactor is weergegeven in figuur 3A. De beschreven protocol kan worden aangepast aan de specifieke eisen van het algemeen een micro-organisme in staat is de vorming van een biofilm. Figuur 3B toont de draaiende schijf met 18 plastic schijven aangebracht. Deze disk-grown biofilms zijn bijzonder goed geschikt voor het testen van antimicrobiële en opbrengst zeer reproduceerbare resultaten ^11.

Figuur 1. Infuus stroming reactor setup. Belangrijke onderdelen zijn gemerkt.

Figuur 2. Voorbeeld van een infuus stroom S. aureus biofilm. A) Dit biofilm werd geteeld voor drie dagen na de beschreven protocol. Deksels van de eerste twee kamers van de reactor zijn verwijderd om de gele S. tonen aureus biofilm biomassa. B) Sacnning electronen microscoop foto van een S. aureus biofilm gegroeid in het infuus stroming reactor.

Figuur 3. De roterende schijf reactor. A) Voorbeeld van een draaiende draaiende schijf reactor. Belangrijk onderdeel zijn gelabeld. B) Close up van een draaiende schijf.

Discussion

Biofilms gekweekt in verschillende reactoren hebben vaak verschillende eigenschappen en elke reactor heeft verschillende toepassingen. In dit werk beschrijven we het gebruik van twee reactoren biofilm: een druppel stroom biofilm reactor en een roterende schijf reactor. Drip reactoren zijn nuttig voor de teelt van lage shear biofilms op een lucht-water grensvlak en zijn aanpasbaar aan verschillende omstandigheden. We vinden ze erg handig voor studies waar een grote hoeveelheid van biofilm biomassa is wenselijk. Deze opstelling kan eenvoudig aangepast worden voor studies met microsensor controle en het testen van potentiële antibiofilm oppervlakken.

De roterende schijf reactor is handig voor de teelt van meerdere identieke biofilm op verwijderen schijven onder een gematigde afschuiving omgeving. Het vermogen van deze reactor om meerdere identieke biofilms produceren op verwijderbare schijven maakt het ideaal voor studies met het testen van antimicrobiële verbindingen en biofilm bestendige oppervlakken. Vele toepassingen zijn mogelijk wanneer het gebruik van deze biofilm reactoren en onderzoekers worden aangemoedigd om het protocol te wijzigen om de beste model van hun specifieke onderzoeksbehoeften.

Deze protocollen bieden alternatieven te stromen cel en statische testen biofilms die zijn meer op grote schaal gebruikt in het verleden. Zij kunnen ook een groter vermogen om diverse klinische infecties na te bootsen. Er zijn echter mogelijke beperkingen bij elke techniek. Bijvoorbeeld, de drip-flow reactoren en roterende schijf reactoren zijn niet ideaal voor het visualiseren van biofilms door confocale microscopie. Ook zal de fysiologie van biofilms gekweekt in de verschillende soorten reactoren waarschijnlijk sterk variëren. Zo zal het infuus-flow reactor resulteren in een biofilm wordt blootgesteld ernstige voedingsstof hellingen, die is heel anders dan de uniforme laminaire stroming van voedingsstoffen media in een flow cel biofilm. Uiteindelijk zal de soort van de gebruikte biofilm reactor is afhankelijk van de vragen worden aangepakt en onderzoekers moeten zich ervan bewust dat er meerdere biofilm reactor systemen zijn beschikbaar voor hun studie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation