Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Summary

Protokollen för att utnyttja öppna biofilmer systemflöde med reaktorer dropp flöde och roterande skiva reaktorer presenteras i detalj.

Abstract

De flesta mikrober i naturen är tänkt att finnas som underlag-associerad samhällen i biofilmer. ¹ Bakteriella biofilmer är inneslutna i en matris och knytas till en yta. ² biofilm bildning och utveckling ofta studeras i laboratorium med parti system som mikrotiterplattor eller flöde system, såsom flow-celler. Dessa metoder är användbara för screening mutant och kemiska bibliotek (mikrotiterplattor) ³ eller växande biofilmer för visualisering (flöde celler) ^4. Här presenterar vi detaljerade protokoll för växande Staphylococcus aureus i ytterligare två typer av biofilmer flödessystem: dropp flödet biofilmen reaktorn och roterande skiva biofilmen reaktor.

Drip flöde biofilm reaktorer är konstruerade för att studera biofilmer odlas under låg skjuvning villkor. ⁵ droppa flödet Reaktorn består av fyra parallella testa kanaler, var och kan hålla en standard glas objektglas storlek kupong, eller en längd av kateter eller snåla. Droppet flödet reaktorn är idealisk för microsensor övervakning, allmän biofilm studier, biofilm cryosectioning prover, hög produktion av biomassa, medicinska utvärderingar material och inneboende medicintekniskt testning. ^6,7,8,9

Den roterande skiva Reaktorn består av en teflon-skiva som innehåller urtag för flyttbara kuponger. ¹⁰ Den avtagbara kuponger som kan göras från någon bearbetbara material. I botten av den roterande skivan innehåller en stavmagnet att låta disken rotera för att skapa vätskeytan klippa över ytan-flush kuponger. Hela skiva som innehåller 18 kuponger placeras i en 1000 ml glasflaska sida armen reaktortanken. En flytande tillväxt media cirkulerar genom fartyget medan skivan roteras med en magnetomrörare. Kupongerna tas bort från reaktortanken och sedan skrapade samla biofilmen prov för vidare studier eller mikroskopi avbildning. Roterande skiva reaktorer är konstruerade för Laboratoriebedömning av biocid effekt, biofilm borttagning, och prestanda för antifoulingsystem material. ^9,11,12,13

Protocol

1. Droppet Flow Biofilm Reactor

1. Droppet flödet biofilm reaktor (finns Biosurface Technologies eller specialdesignade versioner oftast kan göras av universitetet verkstäder, se figur 1) är monterad och autoklaveras. Montering innebär att anbringa kuponger i olika avdelningar och säkra lock kammare. Kammaren, tillsammans med biofilmen medium (Tryptic soja buljong 2 gram / l och glukos 2 gram / l), och inflödet av näringsämnen slangar steriliseras genom autoklavering.
2. Inokulering av dropp flödet reaktorn sker ofta genom att placera reaktorn på en plan yta, fastspänning spillvattnet slangen linjer, fyller varje kammare med 10 ml Tryptic soja buljong och lägga till 10 mikroliter av ett S. aureus kultur vuxit över natten i Tryptic soja buljong. De inokulerade reaktorn plats sedan i 37 ° C inkubator i 18 timmar.
3. Efter 18 timmars inkubation är utflödet slang unclamped och reaktorn placeras på ett träblock kapas till en 10 ° vinkel.
4. Aseptiskt ansluta inflödet av näringsämnen slangen till flaskan med den kontinuerliga buljongen flödet av näringsämnen. Mata slangen linje genom pumpen och främsta rören genom att köra pumpen vid en maximal hastighet (varierar beroende på modell).
5. När inflödet slangen är laddad stoppa pumpen och sätt fast anslut nålar (22 gauge, 1 tum) till slutet av varje rör. Torka av proppen kammaren inlopp med en etanol torka och aseptiskt sätt in nålar genom inloppet propp.
6. Slå på pumpen och låt media att långsamt dropp (flöde ~ 125 ml / minut) över kuponger. Medierna ska flyta nedåt längs med kupong från inloppet proppen port till utflödet porten. Använd reaktorn i kontinuerligt flöde i 2-5 dagar (beroende på program), ibland kontrollera reaktorn för fungerande dränering.
7. Att skörda droppa biofilmer flödet reaktor, stanna pumpen och försiktigt ta bort nålar från reaktorn. Reaktorn kan sedan placeras på en plan yta och kuponger kan aseptiskt bort med hjälp av steril pincett. Om mikroskopi önskas, kan kuponger nu behandlas därefter (Figur 2B är en skanning elektron mikroskop av en S. aureus biofilm odlas i dropp biofilm reaktor). Om kvantifiering av biofilmen biomassa eller studier fysiologi är målet för studien, kan biofilmen tas bort från kupongen med en cell skrapa. Håll kuponger med pincett försiktigt skrapa biofilmen från kupongen i en konisk tub innehåller fosfat saltlösning med en cell skrapa. Observera: att kvantifiera kolonibildande enheter i biofilmer, är det nödvändigt att homogenisera de skördade biofilmer med en vävnad homogenisator dela upp klumpar och bildar en homogen suspension. Olika modeller av vävnad homogeniseringsmaskiner är lämpliga för denna applikation. Vi använder en Fisher Scientific Tissuemiser homogeniseringsblandare (produkt # 15-338-420) i full hastighet under 1 minut för att homogenisera biofilm prover. Underlåtenhet att homogenisera biofilmen kommer att resultera i en underskattning av kolonibildande enheter i provet.

2. Den roterande skiva Biofilm Reactor

1. Den roterande skiva biofilm reaktor (finns tillgänglig från Biosurface Technologies eller kan skräddarsys, se figur 3) är monterade och autoklaveras. Montera reaktorn genom att först placera den snurrande skivan kuponger i spåren av den snurrande skivan och placera den i en 1-liters glasbägare med en overflow-port. Ett antal 15-gummipropp med hål borras i den så att media flöde och luftning används som reaktorn locket. Reaktorn, biofilm media (Tryptic soja buljong 2 g / l och glukos 2 g / L) och inloppsslang sedan steriliseras genom autoklavering.
2. Den roterande skiva biofilm reaktor inokuleras genom att 250 ml av sterilt medium i reaktorn, och lägga till 0,5 ml en övernattning S. aureus kultur odlas i Tryptic soja buljong. Reaktorn placeras sedan på en uppståndelse tallrik satt till 250 rpm och inkuberas över natten vid önskad temperatur.
3. Efter 16 timmars inkubation ansluta inloppsslang till hamnen på medium reservoar och ansluta den till peristaltiska pumpen. Pumpen slår sedan på och flöde satt till ~ 0,25 ml / min (flödet kan ändras beroende på tillväxten önskad takt).
4. Efter 24 timmar stoppa reaktorn och aseptiskt ta ut skivan utan att röra biofilmen kuponger. Ta ut kuponger med steril pincett och doppa var och en i fosfatbuffrad saltlösning för att avlägsna löst bifogade bakterier.
5. För antimikrobiell substans testet kan marker placeras i enskilda brunnar i en 96 brunnar innehållande föreningar av intresse. Efter inkubation, är marker överföras till 1,5 ml rör mikrocentrifug innehåller 1 ml saltlösning fosfatbuffert och homogeniseras med en vävnad homogenisator att skingra intakt biofilmen.
6. Cellerna är sedan seriell späds och pläterade på näringsämnen agarmedium att fastställa livskraftiga koloni Forming enheter.
7. Obs: många variationer kan göras på ovanstående protokoll. Till exempel kan spinning disk kuponger vara belagd med eller upprättas av potentiella anti-biofilm föreningar för att testa effekten. Biofilm dispergeringsmedel kan också bedömas vara inkuberar kuponger i dispergeringsmedel föreningar och kvantifiera bakterier bifogade kontra lossnat.

3. Representativa resultat

Ett exempel på ett inrättat dropp flödet reaktor visas om Figur 1. Efter tre dagar av flödet kopiösa mängder biofilm kommer att samlas på kupongen ytan, figur 2A. Den totala biomassan varierar beroende på bakteriestammar och exakta villkor tillväxt. En skanning elektron mikroskop av en S. aureus biofilm som odlas i droppet flödet reaktorn visas i figur 2B.

En roterande skiva reaktor visas i figur 3A. Protokollet beskrivs kan anpassas till de särskilda kraven i allmänhet någon mikroorganism kan bilda en biofilm. Figur 3B visar den snurrande skivan med 18 plast diskar anbringas. Dessa disk odlade biofilmer är särskilt väl lämpade för antimikrobiell testning och ger mycket reproducerbara resultat ^11.

Figur 1. Droppa flöde reaktor setup. Viktiga komponenter är märkta.

Figur 2. Exempel på dropp flöde S. aureus biofilm. A) Denna biofilm odlades i tre dagar efter den beskrivna protokollet. Locken från de två första kamrarna i reaktorn tas bort för att visa den gula S. aureus biofilm biomassa. B) Sacnning elektron mikroskop av en S. aureus biofilm som odlas i dropp flödet reaktorn.

Figur 3. Roterande skiva reaktor. A) Exempel på en kör spinning disk reaktor. Nyckelkomponent är märkta. B) närbild av en snurrande skiva.

Discussion

Biofilmer odlas i olika reaktorer kommer ofta har olika egenskaper och varje reaktor har olika användningsområden. I detta arbete beskriver vi att använda två biofilm reaktorer: dropp flöde biofilm reaktor och en roterande skiva reaktor. Drip flöde reaktorer är användbara för att odla låg skjuvning biofilmer på en luft-vätska gränssnitt och är anpassningsbara till en mängd olika förhållanden. Vi finner dem oerhört bekvämt för studier där en stor del av biofilm biomassa är önskvärt. Denna inställning kan enkelt anpassas för studier med microsensor övervakning och testning av potentiella antibiofilm ytor.

Den roterande skiva reaktorn är användbara för att odla flera identiska biofilm på ta bort diskar under en moderat skjuvning miljö. Möjligheten för denna reaktor för att producera flera identiska biofilmer på flyttbara diskar gör det idealiskt för studier med testning av antimikrobiella föreningar och biofilm Ytor som är resistenta. Många tillämpningar är möjliga när du använder dessa biofilm reaktorer och forskare uppmuntras att ändra protokollet till bästa modellen deras specifika forskningsbehov.

Dessa protokoll ger alternativ till flödescellen och statiska analyser biofilmer som har använts i större utsträckning i det förflutna. De kan också ge en större förmåga att härma olika kliniska infektioner. Men det finns potentiella begränsningar med varje teknik. Till exempel, drip-flödet reaktorer och roterande reaktorer skiva är inte idealiska för att visualisera biofilmer av konfokalmikroskopi. Dessutom kommer fysiologi biofilmer odlas i olika typer av reaktorer varierar sannolikt stort. Till exempel kommer drip-flödet reaktor resultera i en biofilm utsätts svår näringsämne gradienter, som skiljer sig mycket från den enhetliga laminärt flöde av näringsämnen medier över en flödescell biofilm. I slutändan kommer den typ av biofilm används reaktorn beror på de frågor som tas upp och utredarna bör vara medveten om att flera biofilm reaktorsystem är tillgängliga för sina studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation