Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Summary

Entwicklung von kundenspezifischen Assays auf der ViBE Plattform für empfindlichere, reproduzierbare, automatisierte Ergebnisse in komplexen Matrices beschrieben ist. Die Universal-Kassette ermöglicht Assays zu leicht für die Verwendung mit benutzerdefinierten Tests angepasst werden. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die schnelle Entwicklung und Validierung neuer Tests oder automatisierte Versionen bestehender manueller Tests, in diesem Video veranschaulicht.

Abstract

Benutzerdefinierte Assays für einzigartige Proteine ​​werden oft zeitraubende manuelle Erfassung und Quantifizierung Techniken wie ELISA oder Western Blots auf Grund der Komplexität der Entwicklung auf alternative Plattformen beschränkt. BioScale proprietären Acoustic Membrane Mikropartikel (AMMP)-Technologie ermöglicht Sandwich-Immunoassays zu leicht für die Verwendung auf dem ViBE Plattform entwickelt werden, was eine bessere Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und automatisierten Betrieb. Vorausgesetzt, als Beispiel, werden in diesem Protokoll das Verfahren für die Entwicklung eines benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Host Cell Protein (CHO-HCP)-Assay. Die allgemeinen Grundsätze hier skizzierten kann für die Entwicklung einer breiten Palette von Immunoassays verfolgt werden.

Ein AMMP Assay misst Antigen-Konzentration durch die Messung von Veränderungen in Schwingfrequenz durch die Bindung von Mikropartikeln verursacht, die Sensorfläche zu berechnen. Es besteht aus vier Hauptkomponenten: (1) eine Patrone, die eine funktionalisierte acht Sensor-Chip enthält (2) Antikörper markiert magnetische Mikropartikel, (3) Hapten markierten Antikörper an die Oberfläche der funktionalisierten Chip (4) Proben, die das Antigen bindet Interesse. BioScale der Biosensor ist ein Resonanz-Gerät, das acht einzelnen Membranen mit separatem fluidische Pfade enthält. Die Membranen ändern Schwingungsfrequenz in Reaktion auf Masse ansammeln auf der Oberfläche und diese Frequenz ändern wird verwendet, um die Menge des zugegebenen Masse zu quantifizieren.

Für die Verwendung in einer Vielzahl von Immunoassays der Sensor mit einem Anti-Hapten-Antikörper funktionalisierten erleichtern. Assay spezifische Antikörper werden durch die kovalente Konjugation von Hapten-Tag, um einen Antikörper und Biotin auf die andere geändert. Die Biotin-Markierung verwendet wird, um den Antikörper binden an gekoppelten magnetischen Beads, die in Kombination mit dem Hapten-markierten Antikörper, verwendet werden, um den Analyten in einer Sandwich-Abscheidung Streptavidin. Der Komplex bindet an den Chip durch die anti-hapten/hapten Interaktion. Am Ende eines jeden Testlauf werden die Sensoren mit einer verdünnten Säure ermöglicht die sequentielle Analyse von Spalten aus einer 96-Well-Platte gereinigt.

Hier präsentieren wir die Methode zur Entwicklung eines benutzerdefinierten CHO-HCP AMMP Assay für Bioprozess-Entwicklung. Die Entwicklung AMMP Assays oder die Änderung bestehender Assays in AMMP Assays können eine bessere Leistung (Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit) in komplexen Proben und reduzierte Arbeitszeit. Das Protokoll zeigt die Schritte für die Entwicklung und die Diskussion der Bewertungen repräsentative Ergebnisse. Für eine ausführliche Erläuterung der Assay-Optimierung und Anpassung Parameter Kontakt BioScale. Dieses Kit bietet generische Bioprozessentwicklung Assays wie Residual Protein A, Produkt-Titer und CHO-HCP.

Protocol

1. Mikropartikel-Vorbereitung

1. Label Antikörper mit Biotin NHS Chemie
2. Bestimmung des Grades der Biotinylierung
3. Konjugat Streptavidin Beads mit biotinylierter Antikörper
   1. Resuspendieren der Perlen in der Original-Durchstechflasche durch Vortexen für 1-2 Minuten
   2. Aliquot die gewünschte Lautstärke aus Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen
   3. Waschen Sie die Kugeln 3-mal mit PBST:
      1. Das Röhrchen mit den Perlen auf den Magneten für 2 Minuten
      2. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen mit dem Schlauch auf den Magneten. Achten Sie darauf, um die Perlen zu stören
      3. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten und 1 ml PBST
      4. Vortex für 20 Sekunden, um die Perlen zu resuspendieren
      5. Zentrifugieren Sie für 5 Sekunden, um die Perlen aus der Kappe entfernen
      6. Wiederholen Sie 2.3.1-2.3.5 noch zweimal
   4. Nach dem dritten Waschen statt der Röhre auf dem Magneten und saugen Sie den PBST
   5. Add biotinylierten Antikörper an die Beads und resuspendieren
   6. Bei Bedarf bringen die Lautstärke des biotinylierten Antikörpers bis zu 300 ul mit PBS. Wenn der Antikörper Volumen ist bereits mehr als 300 ul fügen Sie keine PBS
   7. Inkubieren Sie die Perle / Antikörper-Suspension für 30 Minuten bei RT auf dem Vortex-Schüttler oder Tube Rotator
   8. 3 x waschen mit PBST wie in Schritt 3.
   9. Block Perlen mit biotinylierten BSA
      1. Nach dem dritten Waschen add 10 ug / mg biotinylierten BSA, die Lautstärke auf 300 ul mit PBS, wenn nötig, und inkubieren unter Rühren für 30 Minuten
   10. 3 x waschen mit PBST wie in Schritt 3
   11. Resuspendieren der Beads in 100 ul PBS/0.05% BSA. Natriumazid kann für die langfristige Lagerung hinzugefügt werden
4. Mit Standard-NHS Fluorescein-Protokolle, fluoresceinate der Detektor-Antikörper
5. Bestimmen den Grad der Fluorescination

2. HCP - Entwicklung

1. Bereiten Sie funktionierende Lösungen:
   1. Fluorescein-markierten Antikörper (Fl-Ab): Die meisten CHO-HCP-Assays verwenden Fl-Ab bei einer Endkonzentration von 400 ng / mL. Die Fl-Ab als ¼ der endgültigen Assayvolumen hinzugefügt wird, damit die Konzentration der Arbeitslösung beträgt 1,6 pg / mL. Diese Lösung durch Verdünnen Flab Lager mit BioScale Bead / Flab Diluent.
   2. Perlen: Die meisten CHO-HCP-Assays verwenden Perlen an einer Endkonzentration von 2x10 ⁵ Perlen / mL. Die Bead-Reagenz bildet ¼ der endgültigen Assayvolumen, daher die Konzentration der Arbeitslösung ist 8x10 ⁵ Perlen / mL. Diese Lösung durch Verdünnen bead Lager mit BioScale Bead / Flab Diluent. Vortex die Perle Lager auch um sicherzustellen, dass alle Perlen sind in Suspension vor dem Entfernen eines aliquoten.
   3. Laufpuffer: Die Zusammensetzung der Laufpuffer Möglicherweise müssen Sie für die Antikörper verwendet, um den Test zu entwickeln optimiert werden jedoch mehrere CHO-HCP-Assays entwickelt worden sind, mit 10 mM HEPES-Puffer, 1% Tween, pH 7,5. BioScale hat ein Additiv für den Laufpuffer (im Lieferumfang des Development Kit), die in den Puffer zu einer Konzentration von 1% vor Gebrauch hinzugefügt wird entwickelt.
2. Verdünnen Sie die Kalibratoren und Proben mit BioScale Probendiluent.

3. ViBE System Set Up

1. Drehen Sie den ViBE Workstation auf
2. Schließen Sie das System-und-entsorgung
3. Prime das System
4. Legen Sie eine ViBE Cartridge
5. Verlegen Sie die Rohre
6. Bereiten Assay Vorlage, indem Sie das Arbeitsblatt mit der Bezeichnung "Sample Setup". BioScale bietet die Möglichkeit, einen Test Vorlage für jeden ViBE Workstation-Test haben. Dies ermöglicht es dem Benutzer, bearbeiten und speichern Sie bestimmte Noten in den "Notes" Blatt der Vorlage für die verschiedenen Tests, die eine vollständige Aufzeichnung des Experiments.
7. Erste Test-Template eingerichtet: Beginnen Sie mit dem Ausfüllen der Tabelle (oben links) der Konzentrationsbereich der Standards in den Test in der "Sample Setup" Blatt.
8. Als nächstes geben Sie zusätzliche Informationen in der Tabelle auf der rechten Seite des Standards (Simple Spalte Read Setup, ein Reagenz hinzufügen und Zwei-Reagenz Add-Setups), um die ViBE Workstation, wie lange Proben inkubieren müssen anweisen, wie viel Volumen von Reagenz zu übertragenden , wie lange die Probe Akkumulation zu sein braucht, und ob der Sensor ausgestattet und Dekontamination von Sonden und Patrone sind notwendig, etc
9. Füllen Sie die Platte Layout.
10. Laden Probe / Reagenzien in Platten. Der Vibe wird die erforderlichen Volumina für das Reagens Platte. Probenvolumen kann variieren, aber in der Hälfte der insgesamt Assay Volumen von 120 ul ist ein guter Ausgangspunkt.
11. Bewerben Platte abdeckt. Laden Platten auf Workstation-Deck.
12. Führen Sie den Test starten Assistenten durch Assistenten und starten Assay.

4. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1: AMMP Sandwich-Immunoassay Auf einer ViBE Workstation, misst ein AMMP Assay Antigen-Konzentration. Signal wird gemessen, wenn der Wulst-Antigen-Hapten-Antikörper auf den Sensor bindet durch das Hapten / Anti-Hapten-Wechselwirkung. Regeneration bringt der Sensor wieder an den Anfang Staat durch die Beseitigung der Immunkomplexe.

Abbildung 2: CHO-HCP AMMP Assay Kalibrierkurve

Abbildung 2 oben ist ein Beispiel für eine CHO HCP AMMP Assay Kalibrierkurve. Die Analyse kann in Proben aus der ganzen Reinigung Strom einschließlich der Reaktor mit hoher Präzision und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden.

Abbildung 3: Protein A AMMP Assay Kalibrierkurve

Abbildung 3 ist eine Kalibrierkurve für einen Rest-Protein A AMMP Assay, mit einer VIBE Residual Protein A-Assay-Kit durchgeführt. Das gleiche Kit kann für eine schnellere Assay mit einer 30-minütigen Inkubationszeit, oder für empfindlichere Ergebnisse und einen größeren Dynamikbereich mit einer längeren Inkubationszeit ohne Verlust an Präzision und Genauigkeit, die beide in der Regel besser sind als gleichwertig ELISA ist in Benutzern verwendet werden ' Hände

Abbildung 4: Produkt-Titer AMMP Assay

Der Vibe Workstation kann auch für ein Produkt Titer-Test, Ergebnisse in Abbildung 4 dargestellt verwendet werden. Anders als andere AMMP Assays durchgeführt, hat dieser Test keine Probe einer anderen Behandlung als einfaches Verdünnen oder Perlen, und die Quantifizierung hat in "no spin" Proben mit mehr als 10 Millionen Zellen über einen weiten Bereich von Bewohnbarkeit überprüft worden.

Abbildung 5: AMMP Assay Standardkurve für GST-Gadd34 Biomarker Assay

In Abbildung 5 ist ein Standard-Kurve des Signals von der Stimmung BioAnalyzer (Panel A) oder AlphaScreen Technologie unter Verwendung von rekombinanten GST-Gadd34 erhalten. Ergebnisse auf der ViBE Plattform wurden rund ein Protokoll empfindlicher mit dem gleichen Antikörper. AMMP nutzt die Messung von weniger größeren Partikeln dennoch Vorteile aus der Lösung Phase Erfassung und Erkennung der Komplexbildung.

Abbildung 6: AMMP Assay Standardkurve für GST-Gadd34 in Tumorprobe

In Abbildung 6 wurde die Induktion von Gadd34 aus CWR22 Xenotransplantate in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Boronat Proteasom-Inhibitor, wie entweder durch die ViBE BioAnalyzer (Panel A) oder AlphaScreen (Panel B) analysiert getestet. Der Vibe-Plattform war in der Lage, sensible und reproduzierbare Ergebnisse in der in vivo Tumorxenotransplantaten während die AlphaScreen Signal wurde mit einem erhöhten ug Protein abgeschreckt zu produzieren.

Dieses Beispiel zeigt die Macht der AMMP Technologie in komplexen Proben. Aufgrund der empfindlichen Nachweis-Chip und einen hohen Wirkungsgrad des Magneten in der Nähe des Chips kann geringe Anzahl von magnetischen Mikropartikeln effizient und reproduzierbar für niedrige Fülle Ziel mitten in der Komplexität der lysierten Zellen (einschließlich Lyse-Reagenzien) und Blut Schmutz abzufangen.

Discussion

Die vorstehenden Beispiele zeigen, AMMP hochempfindliche quantitative Ergebnisse in komplexen Proben. Diese Leistung, wenn sie mit der Leichtigkeit und Kontrolle der Formatierung Reagenzien in das System geliefert wird, für eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Diese Anträge können spezifisch für ein Ziel, wie in Gadd34 in Tumor, oder allgemein für ein Spektrum von Zielen, wie sie in Wirtszellprotein Detektion und Quantifizierung in Proben, die die Reinigung Strom zu überqueren. Der geringe Overhead ViBE Plattform mit hochflexiblen AMMP kombiniert ein leistungsstarkes Tool für die Bereitstellung von kritischen Tests.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads	BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes	New England Biolabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent	BioScale		to dilute beads and FlAb
Sample Diluent	BioScale		to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive	BioScale