Summary
複雑なマトリックスで、より敏感な、再現性、自動化された結果のViBEプロダクトプラットフォーム上でカスタムアッセイの開発が説明されています。ユニバーサルカートリッジはアッセイが容易にカスタムアッセイで使用するために適応させることができます。この汎用性は、新規アッセイまたはこのビデオに例示される既存のマニュアルアッセイの自動化されたバージョン、の迅速な開発および検証を行います。
Abstract
ユニークなタンパク質のカスタムアッセイは、しばしば時間のかかる手動の検出とそのような代替プラットフォーム上で開発の複雑さのためにELISAやウェスタンブロットなどの定量手法に限定されています。 BioScale独自のアコースティック膜の微粒子（AMMP）技術は、より良い感度、再現性、そして自動化された操作を提供し、サンドイッチイムノアッセイを簡単にViBEプロダクトプラットフォーム上で使用するために開発することができます。一例として提供されて、このプロトコルは、カスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質（CHO - HCP）アッセイを開発するための手順を概説します。ここで概説した一般原則は、イムノアッセイの多種多様な開発のために追跡することができる。
計算するためにセンサーの表面に微粒子の結合による発振周波数の変化を測定することにより、AMMP検定対策の抗原濃度。それは、4つの主要コンポーネントで構成されています。官能化されたeightセンサーチップが含まれている（1）カートリッジ（2）抗体を標識した磁気微粒子を、官能化されたチップの表面（4）の抗原を含むサンプルに結合する（3）ハプテンタグ抗体関心。 BioScaleのバイオセンサーは、別々の流体のパスを持つ8個の膜を含む共振デバイスです。膜は、質量が表面に蓄積し、この周波数の変化は添加量の量を定量するために使用されるに応答して発振周波数を変更してください。
センサは、抗ハプテン抗体と官能化されたイムノアッセイの多種多様な使用を促進する。アッセイ特異的抗体は、1つの抗体と他のビオチンへのハプテンタグの共有結合を介して変更されます。ビオチン標識は、ハプテン-タグ抗体と組み合わせて、サンドイッチで分析物を捕捉するために使用される、結合磁気ビーズをストレプトアビジンに抗体を結合するために使用されます。複合体はanti-hapten/hapten相互作用を介してチップに結合する。各アッセイの最後にセンサーを実行して96ウェルプレートからの列の連続分析を可能に希酸で洗浄されています。
ここで、我々は、バイオプロセス開発のためのカスタムCHO - HCP AMMPアッセイを開発するための手法を提案する。 AMMPアッセイを開発したり、AMMPアッセイに既存のアッセイを変更すると、複雑なサンプルと減少演算子の時間でより良い性能（再現性、感度）を提供することができます。プロトコルは開発のための手順を示し、議論のセクションでは、代表的な結果をレビュー。アッセイの最適化とカスタマイズパラメータのより詳細な説明についてはBioScaleに連絡してください。このキットによりタンパクの残渣、製品の力価、およびCHO - HCPのような一般的なバイオプロセス開発のアッセイを提供しています。
Protocol
1。微粒子の調製
- ビオチンNHS化学を使用してラベルの抗体
- ビオチン化の程度の決定
- ビオチン化抗体とコンジュゲートストレプトアビジンビーズ
- 1〜2分間ボルテックスして、元のバイアルでビーズを再懸濁します
- マイクロ遠心チューブに分注しビーズの目的のボリュームを
- PBSTでビーズを3回洗浄。
- 2分間磁石でビーズを含むチューブを置きます
- 磁石上にチューブで吸引して上清を取り除きます。ビーズを妨害しないように注意してください
- 磁石からチューブを外し、1 mLのPBSTを追加
- ビーズを再懸濁するために20秒間ボルテックス
- キャップからビーズを除去するために5秒間遠心分離します。
- さらに2回2.3.1-2.3.5を繰り返します
- 第三洗浄は、磁石にチューブを配置し、PBSTを吸引除去した後
- ビーズにビオチン化抗体を追加し、再懸濁
- 必要な場合は、PBSで300μLにビオチン化抗体の量を持ち出す。抗体の量は任意のPBSを追加しない既に超えて300μLである場合
- ボルテックスシェーカーまたはチューブローテーターで室温で30分間ビーズ/抗体サスペンションをインキュベート
- ステップ3のようにPBSTで3回洗浄する。
- ビオチン化BSAでビーズをブロックする
- 第三洗浄には10μg/ mgのビオチン化BSAを追加した後、PBS必要に応じて300μLに音量を調節し、30分間撹拌しながらインキュベート
- ステップ3のようにPBSTで3回洗浄する
- PBS/0.05％のBSAの100μLでビーズを再懸濁します。アジ化ナトリウムは、長期保管のために追加することができます。
- 標準NHSフルオレセインのプロトコルを使用して、検出抗体をfluoresceinate
- Fluorescinationの程度を決定
2。 HCP - 開発
- ワーキング溶液の調製法
- フルオレセイン標識抗体（FL - AB）：ほとんどのCHO - HCPアッセイは、400 ng / mLの最終濃度でFL - Abを使用してください。 FL - ABは、ワーキング溶液の濃度が1.6μg/ mLとなるため、最終アッセイ体積の¼として追加されます。 BioScaleビーズ/ぜい肉希釈液でぜい肉の株式を希釈することにより、この溶液を調製します。
- ビーズ：ほとんどのCHO - HCPアッセイは、2 × 10 5ビーズ/ mlの最終濃度でビーズを使用してください。ビーズ試薬は、最終アッセイ体積の¼を構成しているのでワーキング溶液の濃度は、5ビーズ/ mLの8 × 10です。 BioScaleビーズ/ぜい肉希釈液でビーズ株式を希釈することにより、この溶液を調製します。渦ビーズ株式はよく確認するために、すべてのビーズは、アリコートを除去する前に、懸濁液です。
- ランニングバッファー：ランニングバッファーの組成は、アッセイを開発するために使用される抗体のために最適化されなければならないかもしれない、しかし、いくつかのCHO - HCPアッセイは、10mMのHEPES緩衝液を使用して開発された、1％のTween、pH7.5の。 BioScaleは使用前に1％の濃度にバッファに追加されるランニングバッファー（開発キットに付属）のための添加剤を開発しました。
- BioScaleサンプル希釈液で校正し、試料を希釈する。
3。 ViBEプロダクトシステムのセットアップ
- グラスバレーのワークステーションの電源をONに
- システムの供給と廃棄物を接続する
- プライムシステム
- グラスバレーカートリッジを挿入
- チューブを配線します。
- "サンプルの設定"というラベルシートに記入することによってアッセイのテンプレートを準備します。 BioScaleは、それぞれのグラスバレーのワークステーションのアッセイ用のアッセイのテンプレートを持っている機能を提供します。これにより、ユーザーは実験の完全な記録を保持する別のアッセイのためのテンプレートの"注意事項"シート内の特定のノートを編集して保存することができます。
- 初期アッセイのテンプレートは、設定する："サンプルの設定"シートのアッセイの標準の濃度範囲の表（左上隅）を記入することから始めます。
- 次に、試薬の量を転送する場合どの程度、インキュベートする必要があるどのくらいのサンプルがグラスバレーのワークステーションを指示する（単純な列は、一つの試薬の追加と2つの試薬の追加セットアップをセットアップを読む）規格の右側のテーブルに追加情報を入力してください、サンプルの蓄積がする必要があるどのくらいの時間、およびセンサーの調整とプローブとカートリッジの汚染除去が必要かどうか、など
- プレートのレイアウトを記入してください。
- プレートに試料/試薬をロードします。雰囲気は試薬のプレートのために必要なボリュームを提供します。サンプル量が異なりますが、120μLの全アッセイ体積の半分でよい出発点であることができる。
- プレートカバーを適用します。ワークステーションのデッキの上にプレートをロードします。
- ウィザードを起動アッセイを実行、ウィザードの指示に従って移動し、アッセイを開始します。
4。代表的な結果
図1：AMMPサンドイッチ免疫測定法 グラスバレーのワークステーションで、AMMPアッセイは、抗原の濃度を測定する。信号はビーズ - 抗原 - ハプテン抗体がハプテン/抗ハプテン相互作用を介してセンサーに結合するときに測定されます。再生には、免疫複合体を除去することによって最初の状態に戻ってセンサーをもたらします。
図2：CHO - HCP AMMPアッセイの検量線
上記の図2は、CHO HCP AMMPアッセイの検量線の例です。分析は高精度と再現性を持つ原子炉を含む精製ストリーム全体からのサンプルで実行することができます。
図3：プロテインAMMPアッセイの検量線
図3は、VIBE残留タンパク質アッセイキットを使用して実行によりタンパクの残渣AMMPアッセイのための検量線です。同キットは、30分間の潜伏期間を持つ高速なアッセイのための、またはより高感度な結果のために使用され、ユーザーは通常、同等のELISAのより良いが、どちらも精度や正確さを失うことなく、長い潜伏期間を持つ広いダイナミックレンジ、することができます"手
図4：製品タイターAMMPアッセイ
グラスバレーのワークステーションは、結果が図4に示すように、製品の力価検定にも使用できます。他のAMMPアッセイとは異なる方法で実行される、このアッセイは、単純な希釈、またはビーズよりサンプル処理が他の必要としない、と定量は、生存率の広い範囲にわたって1000万人以上の細胞を含む"無スピン"のサンプルで確認されています。
図5：GST - Gadd34バイオマーカーアッセイのためのAMMPアッセイ標準曲線
図5に示すには、グラスバレーバイオアナライザ（パネルA）または組換えGST - Gadd34を使用してAlphaScreenテクノロジーによって得られた信号の標準曲線である。グラスバレーのプラットフォーム上での結果はほぼ同じ抗体を使用して、より敏感なログでした。 AMMPはまだ少数の大きい粒子の液相捕捉および検出複合体形成から、まだ利益の測定を利用しています。
図6：腫瘍サンプル中のGST - Gadd34用AMMPアッセイ標準曲線
図6では、CWR22異種移植片からGadd34の誘導は、グラスバレーバイオアナライザ（パネルA）またはAlphaScreen（パネルB）のいずれかの方法で分析したボロネートプロテアソーム阻害剤の存在下または非存在下で試験された。 ViBEプロダクトプラットフォームはAlphaScreenシグナルはタンパク質の増加μgのでクエンチしたのに対し、in vivoでの腫瘍異種移植片での敏感な、再現性のある結果を生み出すことができた。
この例では、非常に複雑なサンプル中のAMMP技術の力を示しています。チップの近くに磁石の高感度な検出チップや高効率のために、磁性微粒子の低い数字は、効率的かつ再現性よく溶解した携帯電話（溶解試薬を含む）と血液の残骸の複雑さの中に低濃度の目標のために清掃できます。
Discussion
上記の例では、複雑なサンプルにAMMPの高感度定量結果を示す。システムに試薬をフォーマットの使いやすさとコントロールで提供されるこのパフォーマンスは、さまざまなアプリケーションのために有効になっている。それらのアプリケーションは、精製の流れを横切るサンプル中の宿主細胞タンパク質の検出と定量のように、ターゲットのスペクトルのための一般的な腫瘍のGadd34のように、ターゲットに特異的である、または可能性があります。柔軟性の高いAMMPと組み合わせ、低オーバーヘッドの雰囲気のプラットフォームは、重要なアッセイを提供するための強力なツールが用意されています。
Disclosures
この記事の著者は、この記事で使用する機器や試薬の一部を生成するBioscale、株式会社によって雇用されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit | |||
| If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required | |||
| Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9) | |||
| Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | |||
| Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations | |||
| Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab) | |||
| Streptavidin magnetic beads |  BioScale |
(10 mg/mL) ~108 beads/mg | |
| Magnet for microcentrifuge tubes | New England Biolabs | cat # S1510S | |
| Biotinylated BSA for blocking | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| PBS 0.1% Tween 20 | |||
| Vortex | |||
| Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator | |||
| Antibody or protein to be labeled | |||
| NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit | |||
| If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required | |||
| Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | |||
| 50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9) | |||
| Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | |||
| Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm. | |||
| Diluent | BioScale |
to dilute beads and FlAb | |
| Sample Diluent | BioScale |
to dilute samples and calibrators | |
| Running Buffer Additive | BioScale |
