Summary
자기 공명 영상 (MRI)은 유전자 조작 생쥐의 표현형을 조사를위한 점점 인기있는 도구가되고 있습니다. 이 문서는 여러 마우스 MRI를 사용하여 유전자 조작 생쥐의 높은 처리량 phenotyping을 달성하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.
Abstract
자기 공명 영상 (MRI)와 마우스 phenotyping의 분야는 급속하게 인간의 질병의 마우스 모델을 특성화하고 평가하기위한 도구 개선의 필요성에 의해 동기, 성장하고 있습니다. MRI는 유전자 조작 동물을 조사하는 훌륭한 양상이다. 그것은 전체 뇌 보험이 가능합니다 생체내에서 사용할 수 있으며, neuranatomy 및 생리학의 다른 측면을 조사하는 여러 대비 메커니즘을 제공합니다. 여러 개의 마우스를 스캔할 수있는 능력과 함께 높은 분야 스캐너의 출현은 동시에 새로운 변이의 급속한 phenotyping을 허용합니다.
효과적인 마우스 MRI 연구는 실험 설계의 여러 측면에 관심을 필요로합니다. 이 문서에서는, 우리는 시스템을 사용하여 마우스 phenotyping 품질의 이미지를 얻기위한 일반적인 방법을 설명 것을 동시에 차폐 수신 / 송신 주파수의 이미지 마우스 (RF) 일반적인 자석에서 코일 (복 외., 2003). 우리는 특히 해부 phenotyping, 우리의 이미징 센터에서 다양한 마우스 모델에 미치는 영향에 대한 높은 가능성을 보여주었다 중요하고 접근이 응용 프로그램에 중점을두고 있습니다. 우리가 이러한 이미지를 얻기위한 자세한 절차를 제공하기 전에, 생체내 두뇌 이미징 (다자이 외., 2004)와 지적되어야 전직 생체내 두뇌 이미징 (봄 외., 2007)에서 모두 중요한 실용적인 고려 사항이 있습니다. 이들은 아래에 설명되어 있습니다.
Protocol
1. 생체내의 뇌 영상에서 여러 마우스 :
영상 살아있는 동물, 몇 가지 핵심 기능은 이미징 세션에 걸쳐 존재해야합니다 마취, 2 1) 안전한 방법) 환경 제어 및 3) 생리적 모니터링. 또한, 동시에하면 영상 여러 과목, 준비 및 이미지 등록을 촉진하기 동물 위치의 재현성의 용이성과 속도에 대한 복잡성을가 추가됩니다. 따라서, 세 가지 주요 구성 요소 사용자 정의 설계 및 가공되었습니다 준비 및 임베디드 모니터링을 가진 플랫폼이 위치를 표준화로 연결을 촉진하기 위하여 MRI, 유도 챔버 내에서 RF 코일에 마우스를 삽입하는 로딩 시스템을.
로딩 시스템 :
'마우스 하이브'와 '로딩 배열': 마우스 로딩 시스템은 크게 두 부분으로 이루어져 있습니다. 마우스 하이브의 주요 기능은 일곱 밀리 RF 코일 (베리안 NMR 시스템, 팔로 알토, CA) 자석 내부 육각 배열에 구멍을 위치하는 것입니다. 로딩 배열은 마취 가스의 출입을 허용하기 위해 조언을 통해 뚫고 구멍이 50 밀리리터의 원심 분리기 튜브 안에 보관되어 여러 마우스를 잡고 운반하도록 설계되었습니다. 쥐가 anesthetized과 자석의 주변에있는 준비 영역에있는 모니터링 장비 인터페이스 후, 그들은 수정된 원심 튜브에 삽입하고 로딩 배열에 탑재하고 있습니다. 철도 시스템의 모든 생쥐를 장착 후 로딩 배열 수송되고 자석에 삽입 위치. 자석의 구멍을 밀어 때 철도 시스템은 마우스 하이브와 부부로 배열을 수 있습니다. 완전히 자석, RF 코일 내에서 마취 전달 시스템에 원심 분리기 튜브의 도크에 삽입하는 경우. 산소와 혼합 Isoflurane은 각 코일의 축을 따라 튜브를 통하여 마우스 하이브 끝에서 표본에 공급됩니다. 이 마취 가스 혼합물은 생쥐 과거 튜브에 흐름과 로딩 배열의 뒷면 (그림 1)에 부착된 적극적인 청소 단위로 수집됩니다.
유도 회의소 :
이미징 시간이 최소화, 3 시간까지 걸릴 수 있기 때문에 동물의 준비 시간은 마취에 마우스의 노출을 제한하는 데있어 매우 중요합니다. 따라서, 우리는 준비 과정 (그림 2)를 간소화하기 위해 사용자 정의 유도 챔버를 개발했습니다. 사용자 정의 유도 챔버 여러 생쥐의 유도 및 처리 모두에 대해 하나의 환경을 만듭니다. 맑은 아크릴로 구성되어 있고, 유도 챔버 마취 누출을 최소화하기 위해 실리콘 아이리스 포트를 selfclosing 기능과 사용자가 특수 장갑이 필요없이 내부 환경을 액세스할 수 있습니다. 하나의 마우스에 대한 기존의 마스크와 회로에 비해 유도 챔버가 스무 마우스로 집을 수있을만큼 크고 복잡 튜브와 마스크의 부착없이 생쥐 무료 조작을 허용합니다. 단위는 수동 청소 시스템을 사용 수집된 마취 가스의 지속적인 흐름과 함께 제공됩니다. 저항 가열 요소는 준비 기간 동안 동물의 체온을 유지하기 위해 챔버의 바닥을 가열하는 데 사용됩니다.
슬레드 :
MRI에 대한 쥐를 준비의 가장 어색하고 시간이 소요되는 부분 중 하나는 electrocardiograph (ECG) 전극과 직장 온도 프로브의 응용 프로그램입니다. 또한, 이러한 수갑을 채워 바늘 전극으로 종래의 전극, 많은 그것은 어려운 위치를 표준화하는 동물의 자세를 왜곡 발견되었습니다. 따라서, 우리는 임베디드 ECG와 사용자 지정 양식 - 장착되어 위치 플랫폼을 고안, 호흡 및 온도 프로브는 '썰매'(미국 특허 7,146,936) (그림 3)을했다. 벨크로의 체결로 만든 모션 지지대는 머리의 움직임을 제한하는 데 사용되었습니다.
생체내 두뇌 이미징 단계에서 여러 마우스 :
- 모든 마우스 연구는 마우스 처리 절차에 대한 지역 ACC (애니멀 케어위원회), IACUC (기관 애니멀 케어 및 사용위원회) 또는 이와 동등한 승인이 필요합니다.
- 이러한 동물의 식별 및 무게 등 모든 절차는 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서와 MRI 단위에서 수행되어야합니다. 동물 autoclavable 플라스틱 용기에 양도하고 MRI 유도 챔버로 이송됩니다.
- 마우스 L / 산소 분 4퍼센트 isoflurane과 4를 사용하여 prewarmed 유도 챔버에 anesthetized 있습니다. 그들이 발 핀치에 대응하지 않는 한 동물 완전히 anesthetized 있습니다. 가슴에서 모피는 ECG와 사용자 정의 썰매가 내장되어있다 온도 모니터링 장치와 더 나은 접촉을 제공하기 위해 필요한 경우 머리 제거제 (나이르)를 사용하여 제거됩니다. 이브 연고 (눈물 Naturale PM)은 건조 방지하기 위해 눈을에 적용하고, 호수의 약 0.3 ML은 수화를 유지하기 위해 subcutaneously 관리합니다.
- GD - DTPA - BMA, 엿 (Omniscan) 5 월콘트라스트 향상을 원하는 경우 사용합니다. GD - DTPA가 사용하는 경우, 그것은 호수 (최종 볼륨 300uL)에 희석하여 IP를 통해 이전 MR 세션 1 mmol / kg의 단일 복용으로 시행됩니다.
- 생쥐는 다음 개방 50mL 원뿔 관에 머리 스트랩과 슬라이드 (그림 3)과 고정, 개별 sleds에로드됩니다. 최대 7 살 생쥐는 한 번에 스캔 수 있습니다. 일단 모든 동물은 연결 생리 감시와 함께 로드된 8 L / 분, 2 %와 산소 수준으로 낳은 자석에서 isoflurane 수준을 설정합니다.
- 원뿔 튜브가 낳은 자석의 중앙에 위치 각 RF 코일에 균일하게 위치하도록 설계된 마우스 도킹 시스템 (그림 1)에 탑재하고 있습니다. 일단로드, isoflurane은 0.9-2 %까지 줄일 수 있습니다. ECG 및 온도는 스캔 과정을 통해 각 동물에 감시하고 있습니다. 동물은 예열 공기를 스캔 과정 동안 따뜻한 보관됩니다.
- 각 입체 스캔 기간은 약 3 시간입니다. 자세한 내용은 다음과 같습니다 2300 MS와 MS 36 TEeff의 TR로 고속 스핀 에코. 일 평균 8 기차 길이를 에코. 결과 이미지 해상도 125 μm의 (그림 4)입니다.
- 검사가 완료되면, 동물은 자석에서 제거하고 100 % 산소로 가득한 따뜻한 유도 챔버에서 언로 드됩니다. 동물은 플라스틱 밀폐 용기로 전송하고 BSC에 따라 수송하고 있습니다. 그들은 따뜻한 초안 무료 케이지에 위치하고 마취에서 회복하기 위해 사용할 수 있습니다.
2. 여러 마우스 예 생체내 브레인 이미징 :
모션 아티팩트에 영향을받지 고정 MR 영상 라이브 영상보다 더 높은 해상도를 실현하고 있습니다. 높은 해상도, 3 차원 데이터 세트는 양적 정보를 추출에서 최대한의 유연성을 제공하고 자동 이미지 분석을 위해 수 있습니다. 사용자 정의 RF 코일 배열은 하룻밤 스캔 세션에서 인 - 두개골 마우스 두뇌 고정 16 고해상도 MR의 데이터 세트의 병렬 취득하기 위해 개발되었습니다.
16 코일 전의 생체내 브레인 이미징 배열 :
맞춤식 16 코일 솔레노이드 어레이는 동시에 16 이미지 샘플을 위해 만들어졌습니다. 이 디자인은 60mm 삽입 기울기 집합에 동시에 이미지를 세 개나하는 데 사용 이전에 프로토 타입을 향상시킵니다. 8 턴 솔레노이드 코일은 26mm의 길이 10여 % 이내로 균일 감도를 제공하는 끝에 상처 이상 개별적으로 모듈형 구획 (Idziak 및 Haeberlen, 1982) 내에 차폐 수 있습니다. 16 코일 구획은 움직임을 최소화하기 위해 공기 방광을 사용하여 장소에 그라디언트 내의 코일 및 클램프를 위치 프레임 (그림 5)에 조립합니다.
여러 마우스 예 생체내 두뇌 이미징 단계 :
- anesthetized 마우스의 심장의 좌심실에 오픈 흉강 및 삽입 바늘 (또는 안전 빙게드 주입 세트, 25G × 3 / 4) (intraperitoneal 300ml의 사출 (150 MG / kg)과 xylazine (10 MG / kg)를 통해 . 오른쪽 외이 컷.
- 30 ML 룸 온도 1 플러시 Transcardiac 재관류 X PBS + 1 μL / ML의 헤파린 (/ 1000 USP 단위 ML) 약 100 ML / HR의 흐름 속도 + 2 MM의 ProHance.
- 100 고정 패스 30 ML 4% PFA와 (상온) + 2 MM의 ProHance ML / HR.
- 피부, 아래턱, 귀, 코 연골 팁 목을 벨 및 제거합니다.
- 4 박 플레이스 남아있는 두개골의 구조는 4 %에 PFA + 2 당연 ProHance ° C.
- 1X PBS + 0.02 % 나트륨 azide + 2 MM의 ProHance로 전송.
- 7 테슬라에서 고해상도 입체 MRI 스캔은 재관류 후 4 일없는 이상보다 2.5 개월 사이에 발생합니다. 두뇌는 16 채널 솔레노이드 코일 배열 (그림 5)에 배치됩니다.
- 이미징 매개 변수는 다음과 같습니다 : 빠른 회전 TR 325 MS와 에코 4 평균 6 개 30 MS, 에코 기차 길이 TEeff. 마지막 이미지는 32 μm의 해상도의 등방성 (그림 6)을하고 검사 기간은 약 12 시간입니다.
- 스캔 후, 포르말린 10 % 두개골을 보존 장소 + 2 MM의 ProHance합니다.
3. 대표 결과 :
그림 1. 마우스 로딩 시스템. "로딩 배열"과 "마우스 하이브는"일반적인 유리 섬유 레일 시스템과 연결되어 있습니다.
그림 2. 유도 챔버.
그림 3.) 썰매, 임베디드 모니터링 센서 및 머리 구속되었습니다. B) 머리 자제심과 썰매에 anesthetized 마우스 첨부. 슬레드 어셈블리 쉽게 원심 튜브에 슬라이드.
그림 4. 생체내 여러 뇌 이미지> 대표.
그림 5. 16 고정 뇌 표본의 스캐닝을위한 16 채널 솔레노이드 코일 배열입니다.
그림 6. 대표 전 생체내 두뇌 이미지.
Discussion
생체내 및 이미징 시간을 늘리지 않고 상당히 이미징 연구의 처리량을 증가시킬 한 번에 전 생체내 마우스 이미징 시스템 이미지를 여러 과목에서 모두. 생체내 및 전 생체내 여러 마우스 이미징 기술에 모두에서 뇌 이미지는 높은 품질이며 각각 마우스 두뇌의 주요 및 사소한 구조를 phenotyping에 적합합니다.
여러 표본의 동물 준비 시간을 최소화하기 위해 프로세스 parallelization는 최고 중요성이다. 예를 들어, 유도 챔버의 개발은 동시에 여러 표본의 유도에 대한 허용 및 신체 위치를 표준화하면서 썰매 ECG 및 온도 프로브의 응용 프로그램을 동기화하고 있습니다. 또한, 우리의 옛 생체내 이미징 시스템은 높은 처리량 phenotyping 연구에 이상적입니다 한 번에 16 고정 전체 두뇌의 고해상도의 입체 영상을 얻은 우리에게 있습니다.
생체내 이미징 시스템에서 우리의 가능한 제한이 개별적으로 각각의 마우스에 대한 마취 및 온도를 제어하는 무능력을 포함합니다. 필요한 각각의 마취 관리는 각 마우스 전용 마취 vaporizers의 추가로 구현할 수있다면. 생체내 이미징 시스템의 또 다른 한계는 검사가 약 32g 미만 마우스로 제한되어있다는 점이다. 그러나, 큰 동물을 수용하기 위해 코일의 크기를 증가 현재 계획이 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 아픈 어린이 병원과 토론토 대학에서 마우스 이미징 센터 (MICE)의 일부입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP (AErrane) | Baxter Internationl Inc. | CA2L9108 | |
| NAIR | Church & Dwight Co. | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | DIN 02082519 | |
| Omniscan (gadodiamide injection USP) | GE Healthcare | J-110A | |
| Custom Sleds | Dazai Research Instruments | ||
| PBS w/o Ca and Mg | Wisent Inc. | 311-010-CL | |
| Heparin 10000USP/10ml | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02264315 | |
| ProHance (gadoteridol injection USP) | Bracco Diagnostics | 11181 | |
| Parafolmadehyde (powder) | Sigma-Aldrich | P-6148-500g | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| Formalin 10% | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M.
- Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI. Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).
- Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).
- Idziak, S., Haeberlen, U. Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR. J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).
