Summary
وعائقا رئيسيا أمام التحليلات الكيميائية الحيوية للريبوسوم تحتوي الوليدة ببتيديل - tRNAs تم بحضور ريبوسوم أخرى في نفس العينات ، ريبوسوم لم يشارك في الترجمة من تسلسل مرنا محددة يجري تحليلها. وضعنا منهجية بسيطة لتنقية ، حصرا ، على ريبوسوم تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال - ببتيديل الوليدة من الفائدة.
Abstract
مؤخرا ، لم مفصلة الدراسات البنيوية والبيوكيميائية العديد من الأحداث الجزيئية التي تحدث في الريبوسوم خلال تثبيط تخليق البروتين بواسطة المضادات الحيوية ، وخلال التوليف ببتيد الوليدة. بعض هذه المضادات الحيوية ، والبروتينية الوليدة التنظيمية معظمها في شكل ببتيديل - tRNAs ، إما تمنع تشكيل ببتيد السندات أو إنهاء الترجمة 1-7. ووصف ظاهرة المثبطة هذه الأحداث يمكن أن يوقف حركة الريبوسوم "اعتقال متعدية". وقد تبين اعتقال الترجمة الناجمة عن المضادات الحيوية an إما أو ببتيد الوليدة لتنظيم التعبير عن جينات لها دور في الوظائف الخلوية متنوعة مثل نمو الخلايا ، ومقاومة المضادات الحيوية ، إزفاء البروتين واستقلاب الخلية 8-13. معرفة كيفية المضادات الحيوية والبروتينية الوليدة يغير وظيفة تنظيمية الريبوسوم أمر ضروري إذا أردنا أن نفهم الدور الكامل للالريبوسوم في الترجمة ، في كل حي.
هنا ، نحن تصف منهجية بسيطة التي يمكن استخدامها لتنقية ، حصرا ، للتحليل ، تلك ريبوسوم ترجمة ومرنا محددة ومعينة تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال ببتيديل - 14. ويستند هذا الإجراء على العزلة الانتقائي للريبوسوم ترجمة منضم إلى مرنا البيوتين المسمى. وتفصل هذه المجمعات متعدية من ريبوسوم أخرى في الخليط نفسه ، وذلك باستخدام الخرز ممغطس streptavidin (SMB) ، والمجال المغناطيسي (وسط). وقد تم تجميع mRNAs البيوتين المسمى النسخ بواسطة فحوصات الاعادة باستخدام القوالب وشظايا الحمض النووي لتوليد PCR التي تحتوي على المروجين T7 النسخي. T7 بوليميريز RNA تتضمن البيوتين - 16 - UMP من البيوتين UTP ، في ظل ظروفنا وتدمج ما يقرب من عشرة البيوتين - 16 - UMP الجزيئات في الإقليم الشمالي 600 مرنا مع الحزب الحاكم على نسبة 25 ٪. ثم يتم عزل هذه البيوتين المسمى mRNAs ، واستخدامها في المختبر في إجراء فحوصات الترجمة مع عامل الإصدار 2 (RF2) - المنضب خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها مقتطفات من سلالات كولاي التي تحتوي على نوع البرية أو ريبوسوم متحولة. وتعثرت ريبوسوم ترجمة البيوتين المسمى متواليات مرنا في المنطقة رامزة توقف ، ونظرا لغياب بروتين RF2 ، الذي يحقق في العادة إنهاء الترجمة. معزولون ريبوسوم المتعثرة التي تحتوي على توليف حديثا ببتيديل - الحمض الريبي النووي النقال وإزالتها من ردود الفعل والترجمة باستخدام SMB MF ملف. هذه الخرز فقط ربط البيوتين المحتوية على الرسائل.
يمكن استخدام معزولة والمجمعات متعدية ، وتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية من النوع البري أو مكونات الريباسي متحولة ، أو تسلسل الحمض الريبي النووي النقال ببتيديل ، وكذلك تحديد الريبوسوم التفاعل مع المضادات الحيوية أو غيرها من العوامل الجزيئية 1،14-16. لفحص وظيفة هذه المجمعات الريبوسوم معزولة ، يمكن إجراء فحوصات ببتيديل - ترانسفيراز في وجود المضادات الحيوية بوروميسين 1. لدراسة التغيرات الهيكلية في المجمعات متعدية ، يمكن استخدام إجراءات راسخة ، مثل ط) يشابك إلى الأحماض الأمينية المحددة 14 و / أو الثاني) المقايسات حماية ألكلة 1،14،17.
Protocol
1. الخلية الحرة إعداد استخراج.
- غرام اثنين من البكتيريا القولونية الجافة بيليه تم الحصول عليها من منتصف سجل تغسل الثقافات المرحلة ، مرتين ، مع نصف ليتر من العازلة التي تحتوي على 10 ألف ملي تريس - أسيتات ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 14 المغنيسيوم خلات ملم ، 60 ملم اسيتات البوتاسيوم ، و50 ميكروغرام / phenylmethanesulphonylfluoride مل (PMSF) بواسطة الطرد المركزي في 5000 X ز لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. بعد الغسيل ، هو بيليه معلق الجرثومي في 40 مل من ألف العازلة
- تتعطل الخلايا البكتيرية باستخدام الصحافة الفرنسية ، وتطبيق ضغط 6000 رطل في البوصة المربعة. هذا الضغط يناظر 600 وحدة باستخدام مكبس واحد بوصة. يتم جمع نظام التعليق تعطلت في أنبوب زجاجي نظيف (50 مل).
- يتم التعامل مع تعليق تعطلت dithiotreitol ملي 1 (DTT) ، وطرد في XG 30000 لمدة 30 دقيقة. ويتكرر هذا الإجراء الطرد المركزي ، وذلك باستخدام طاف الناتجة عن ذلك. والاستغناء عن طاف النهائي (1 مل) في microtubes. أخيرا ، يتم تجميد aliquots باستخدام الثلج الجاف ، أو خليط الايثانول النيتروجين السائل ، ويتم تخزينها في -60 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
2. إعداد مقتطفات من الحر خلية RF2 المنضب.
- تختلط 4.5 مل من البروتين والطين 4B الخرز sepharose مع 5 مل من المصل المضاد لمكافحة RF2 باستخدام عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. يتم طرد الخليط في 2500 XG لفصل حبات من مصل. على التخلص من طاف ، تغسل في وقت لاحق هذه الخرز التي تحتوي على أضداد RF2 (المضادة للRF2 الخرز) من إعادة تعليق في 1 مل من B العازلة التي تحتوي على 35 مم ، تريس اسيتات الرقم الهيدروجيني 7.8 ، 10 خلات المغنيسيوم ملم ، 30 ملم خلات الأمونيوم ، 60 البوتاسيوم الغلوتامات ملي و 5 ميكروغرام / مل من بروتين مثبط leupeptin. ثم يتم فصل حبات مكافحة RF2 من B عازلة بواسطة الطرد المركزي تستخدم نفس الشروط المشار إليها أعلاه. ويتكرر هذا الإجراء الغسيل مرتين.
- يتم خلط واحد مل من مستخلص خالية من الخلايا مع 150 ميكرولتر المضادة للRF2 الخرز باستخدام عجلة دوارة ، في 4 درجات مئوية ، لمدة ساعتين. يتم طرد الخليط في 10000 XG لفصل استخراج الخلايا خالية من الخرز. تتم إزالة طاف وتعامل جديد مع آخر ميكرولتر 150 المضادة للRF2 الخرز. ويتكرر هذا الإجراء مرة أخرى مع الحل الناتجة استخراج خالية من الخلايا. والاستغناء عن حل نهائي استخراج خالية من الخلايا (100 ميكرولتر) في microtubes. وجمدت aliquots باستخدام الثلج الجاف ، أو خليط الايثانول النيتروجين السائل ، ويتم تخزينها في -60 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
3. إعداد قالب الحمض النووي.
- إعداد 1 مل PCR - 600 femtomoles رد فعل من جانب اختلاط القالب البلازميد التي تحتوي على أن تترجم تسلسلات (الشكل رقم 1) ، مع 0.4 nanomoles كل من oligodeoxynucleotides مبين في الشكل رقم 1 ، 0،2 micromoles كل dNTP و 50 U - طاق بوليميريز الحامض النووي في المنطقة العازلة التي توفرها شركة Stratagene نفذ تضخيم رد الفعل وفقا للشروط التالية : 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، لمدة 30 دورات) و 72 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
- تنقية PCR المنتجات التي عجل الحمض النووي عن طريق إضافة وحدة التخزين 1 / 10 من 3 خلات الصوديوم م ، ودرجة الحموضة 5.2 ، و 2 مجلدات من الايثانول الجليد الباردة. كرر الإجراء هطول الأمطار مرة أخرى. Resuspend الحمض النووي في 100 ميليلتر من ثنائي اثيل - pyrocarbonate (DEPC) المعاملة المياه.
عادة ، هذا الإجراء غلة 100 ميكروغرام من الحمض النووي منتج 600 سنة مضت. - التحقق من سلامة المنتجات PCR بواسطة الرحلان الكهربائي على المواد الهلامية agarose.
4. إعداد مرنا البيوتين المسمى.
- إعداد ميكرولتر 100 في رد فعل النسخ في المختبر DEPC المياه المعالجة عن طريق خلط 5 ميكروغرام من الحمض النووي جزء PCR ولدت مع 0.5 micromoles للاعبي التنس المحترفين ، CTP ، GTP ، 0.3 micromoles من UTP ، 50 nanomoles من البيوتين UTP - 16 ، و 10 ميكرولتر مزيج من انزيم T7 في المنطقة العازلة التي توفرها شركة Promega احتضان خليط التفاعل عند 37 لمدة 3 ساعات درجة مئوية.
لقياس كمية من الحصول على مرنا ، ينبغي التخلص من الحمض النووي عن طريق إضافة قالب ريبونوكلياز خالية الدناز. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. - تنقية المنتجات مرنا بواسطة الحمض النووي الريبي عجل بإضافة حجم 1 / 10 من 3 خلات الصوديوم م ، ودرجة الحموضة 5.2 ، و 2 مجلدات من الايثانول الباردة. كرر الإجراء هطول الأمطار مرة أخرى. Resuspend ومرنا في 100 ميليلتر من الماء DEPC المعاملة.
عادة ، وصفت هذا الإجراء الغلة بين 1-2 ملغم من البيوتين NT 600 المنتج مرنا. - التحقق من سلامة المنتجات مرنا البيوتين المسمى الكهربائي على المواد الهلامية التي agarose.
5. عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - الحمض الريبي النووي النقال.
- إعداد 500 ميكرولتر من الترجمة في المختبر خليط التفاعل في DEPC المياه المعالجة عن طريق خلط 10-15 ميكروغرام من البيوتين المسمى مرنا مع 75 nanomoles كل من الأحماض الأمينية nineteen للجميع باستثناء الأحماض الأمينية التي سيتم الاستعاضة عن حمض أميني المشعة ، 50 μCi من الأحماض الأمينية المشعة (37MBq) ، و20-5 0 ميكرولتر من استخراج خلايا خالية RF2 - المنضب ، في خليط التفاعل مخزنة تحتوي على 40 مم ، خلات تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 المغنيسيوم خلات ملي و 175 ملي اسيتات البوتاسيوم ، 10 خلات الأمونيوم ملم ، 2 ملم DTT ، ATP 2 مم ، 0.5 GTP ملي و 30 ملي الفسفوإينول (PEP) ، 0.3 كيناز البيروفات يو / مليلتر (PK) ، 3.5 ٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000 ، سبيرمدين 1 ملم ، 20 ميكروغرام / حامض الفولينيك مل ، و 250 ميكروغرام / مل من الحمض الريبي النووي النقال E. القولونية. احتضان خليط التفاعل في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية.
ترتيب إضافة مكونات التفاعل مهم جدا. يجب أن تكون مختلطة في استخراج الخلايا الحرة الأولى مع الحل العازلة التي تحتوي على الأحماض الأمينية والخليط النهائي المحتضنة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح لتفعيل ريبوسوم. في وقت لاحق ، يتم إضافة البيوتين المسمى mRNAs. للتحليلات الهيكلية باستخدام إجراءات تعديل المادة الكيميائية ، لا يطلب من إضافة حامض أميني المشعة. - إضافة إلى ترجمة خليط التفاعل -- 3 مل من الخرز ممغطس streptavidin (SMB) معلقة في C العازلة التي تحتوي على 35 مم ، خلات تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 المغنيسيوم خلات ملي و 175 ملي اسيتات البوتاسيوم ، و 10 ملم وخلات الأمونيوم DTT 1 ملم. احتضان تعليق جديد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- فصل خليط من الشركات الصغيرة والمتوسطة من خلال تطبيق مجال مغناطيسي (وسط) يقف باستخدام مغناطيس.
- Resuspend على الشركات الصغيرة والمتوسطة في C العازلة وفصل حبات مرة أخرى باستخدام القوة المتعددة الجنسيات. كرر هذا الإجراء الغسيل مرتين. Resuspend الخرز في 500 ميليلتر من C العازلة ، وتخزين التعليق على الجليد ، وتنفيذ الإجراء التالي على الفور.
6. تحليل ريبوسوم المعزولة احتواء ببتيديل - الحمض الريبي النووي النقال.
لببتيديل - الحمض الريبي النووي النقال
- مزيج 10 ميكرولتر من SMB (C معلقة في المخزن) مع 10 ميكرولتر من العازلة تحميل يحتوي على 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.8 ، و 2.5 ٪ (V / V) الجلسرين ، و 4 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل ، 2 ملم وDTT 0.2 ملغ / مل زرقة البروموفينول. حل المكونات التي تعلق على الخرز عن طريق تشغيل عينات المواد الهلامية في 10 ٪ بولي أكريلاميد تريس - tricine.
- تجفيف المواد الهلامية هلام باستخدام فراغ مجفف.
- التحقق من سلامة وتنقية ببتيديل - الحمض الريبي النووي النقال من خلال تعريض الجل المجفف إلى فيلم الأشعة السينية.
عن RNA الريباسي
- إضافة 190 ميكرولتر من 2 الحل ملم (EDTA) ethylenediaminetetraacetate أعدت مع DEPC معاملة المياه ، و 200 ميكرولتر من الفينول معايرتها مع الماء ، إلى 10 ميكرولتر من تعليق خرزة. مزيج التعليق من vortexing قوية ومستقلة وغير العضوية المرحلة من مرحلة العضوية بواسطة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جمع طبقة المياه أعلى في microtube جديدة.
- ترسيب الحمض النووي الريبي من طبقة المياه بإضافة حجم 1 / 10 من 3 خلات الصوديوم م ، ودرجة الحموضة 5.2 ، 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل من محلول الجليكوجين ، و 2 كميات من الجليد الباردة الايثانول. Resuspend الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر من DEPC معاملة المياه.
- التحقق من سلامة الرنا الريباسي الكهربائي على المواد الهلامية التي agarose.
عادة ، 50 ميكرولتر من غلة الوقف الخرز 1μg من الحمض النووي الريبي الريباسي.
7. ممثل النتائج :
الشكل 2 يعرض نتائج سلسلة من التحليلات تقييم الجودة والأداء الوظيفي للريبوسوم ترجمة معزولة باستخدام الإجراء المذكورة. مراقبة فرقة فريدة حلها في المواد الهلامية بولي أكريلاميد يدل على وجود البروتينية منضمة إلى mRNAs البيوتين المسمى تعلق على الشركات الصغيرة والمتوسطة (الشكل 2A). تنقية من RNAs الريباسي باستخدام هذا الإجراء يؤسس وجود ريبوسوم منضمة إلى هذه mRNAs البيوتين المسمى ، وكذلك (الشكل 2B). إضافة بوروميسين ، بمضاد حيوي الحث على النشاط ببتيديل - ترانسفيراز من الريبوسوم ، والنتائج في الشق من tRNAs ببتيديل الوليدة - 1. كما لوحظ هذا التحول في نمط الهجرة من ببتيد معزولة في بولي أكريلاميد المواد الهلامية (الشكل 2C). معا ، وهذه البيانات تشير إلى أن البيوتين المسمى mRNAs تعلق على SMB تحتوي ريبوسوم الوظيفية مع ببتيديل - tRNAs.
عزلة ريبوسوم تحتوي على ترجمة معينة ببتيديل - tRNAs تصاريح دراسة آثار ببتيديل - tRNAs ، والمضادات الحيوية ، والجزيئات الأخرى ، على وظيفة الريبوسوم (الشكل 3A) ، وعلى بنية الريبوسوم (الشكل 3B) في الأمثلة المعروضة هنا سبارسوميسين المضادات الحيوية وحمض تريبتوفان الأميني (التربتوفان) تمنع الانقسام الناجم حلمهي من الحمض الريبي النووي النقال الوليدة ببتيديل - tnaC بواسطة الحمض الريبي النووي النقال - RF2 في ريبوسوم معزولة (الشكل 3A). تفاعل التربتوفان سبارسوميسين أو مع الريبوسوم يدفع أيضا تغييرات هيكلية في بعض النيوكليوتيدات التي تشكل الرنا الريباسي 23S من الريبوسوم ترجمة (الشكل 3B). باختصار ، وصف المواد البيولوجية التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء هنا هي مفيدة في الحصول على فهم إضافية للاتصالات تشارك في الهيكلية تثبيط وظيفة الريبوسوم عند تفاعلها مع العوامل الجزيئية المختلفة.
ove_content ">
الشكل 1. الإجراءات المستخدمة لإنتاج وتنقية ريبوسوم ترجمة تحتوي ببتيديل - tRNAs. الحمض النووي شظايا كاليفورنيا. وتستخدم 650 غليان في الطول ، والتي تحتوي على الجين tnaC والمنطقة المتاخمة لها ، كما هو موضح في الشكل ، كما في إعداد قوالب mRNAs تحتوي على البيوتين ، [(البيولوجية) UMP] مرنا. ويتم إنتاج هذه الأجزاء الحمض النووي عن طريق إجراءات PCR باستخدام oligodeoxynucleotides أشار في الجزء العلوي من هذا الرقم. رسائل وأكد علامة في موقع المروج T7 المشفرة في التمهيدي النوكليوتيدات. بأحرف بارزة تشير إلى تسلسل تلميع - Dalgarno يستخدم في ترجمة تسلسل tnaC مرنا. يتم التعرف على المروج T7 في جزء بواسطة الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 الذي يستخدم لنسخ (السهم) تسلسل tnaC والمصب تسلسل غير الترميز. عندما يتم إنهاء النسخ بوليميريز RNA تصل إلى نهاية 3' - جزء من الحمض النووي ، وبعد تسلسل فاصل rpoBC (rpoBC "تي"). الهيكل الجذعية حلقة من فاصل rpoBC مرنا يحمي من 3' - 5 'exoribonuclease الحاضر النشاط في مقتطفات خالية من الخلايا المستخدمة في الترجمة في ردود المختبر. وتستخدم في عزل [(البيولوجية) UMP] mRNAs لتوليد المتوقفة ، ريبوسوم ترجمة ، وذلك باستخدام فحوصات في المختبر الترجمة. تسلسل tnaC في [(البيولوجية) UMP] ترجمة مرنا من الأكشاك التي الريبوسوم عندما يتم إدراج حمض أميني آخر ، ونظرا لغياب عامل النسخة (RF2) من خليط التفاعل. الريبوسوم - [(البيولوجية) UMP] مجمعات معزولة مرنا من خليط التفاعل الكلي باستخدام streptavidin المغناطيسي ، الخرز (SMB) التي تربط بين البيوتين المسمى النيوكليوتيدات أدرجت في mRNA. الشركات الصغيرة والمتوسطة في منضمة إلى الريبوسوم - [(البيولوجية) UMP] يتم استخراج المجمعات مرنا من خليط التفاعل الكلي باستخدام المجال المغناطيسي (وسط).
الشكل 2. التحليلات الإنشائية والفنية للمجمعات معزولة. أجريت A) في المختبر مع ردود فعل الترجمة [(البيولوجية) UMP] mRNAs التي استعيض عن كودون بداية الجين tnaC بواسطة رامزة التوقف. وقد تم عزل المنتجات النهائية باستخدام الخرز streptavidin ، كما هو مبين في الشكل رقم 1. ثم جرى تحليل منتجات التفاعل والجزيئات التي عزلها عن المواد الهلامية بولي أكريلاميد الكهربائي. يتم وضع علامة على tnaC - الحمض الريبي النووي النقال وشرائح tnaC الببتيد. ب) تم عزل الحمض النووي الريبي من مجموع المجمعات المتعثرة باستخدام إجراءات استخراج الفينول. وتم حل كل الحمض النووي الريبي التي عزلها الكهربي في المواد الهلامية agarose. يشار إلى الرنا الريباسي (rRNAs). C) وحضنت مجمعات معزولة تحتوي tnaC - tRNAs مع (+) أو بدون (--) 0.02 مم بوروميسين (بورو) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. وقد وصفت الببتيد tnaC خلال الترجمة باستخدام [35S] - ميثيونين (A) أو [3H] - برولين (B).
الشكل 3. التحليلات الهيكلية والوظيفية للريبوسوم تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال tnaC ، التي هي ملزمة لسبارسوميسين المضادات الحيوية ، أو حمض تريبتوفان الاميني. A) وحضنت مجمعات معزولة تحتوي tnaC - tRNAs مع (+) أو بدون (--) سبارسوميسين (سبار) أو التربتوفان (التربتوفان) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في وقت لاحق ، وكانت مختلطة مع الخلائط RF2 والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ب) تحليل التغييرات مثيلة في الرنا الريباسي 23S التي تسببها الجزيئات داخل ملزمة الريبوسوم. وكانت مجمعات معزولة قبل المحتضنة مع (+) أو بدون (--) 2 ملم أو التربتوفان سبار لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم ، أضيف عامل ألكلة ، ثنائي ميثيل سلفات ، ومخاليط حضنت في درجة حرارة الغرفة للحصول على 20 دقيقة إضافية. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع وأجريت فحوصات تمديد التمهيدي مع [32P] المسمى oligodeoxynucleotide مكملة لالنكليوتيدات من الرنا الريباسي 23S التي متباعدة 100 النيوكليوتيدات النوكليوتيدات المصب من تعديلها. تم حل هذه المنتجات النهائية للفحوصات التمديد الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد. وأشار 23S الرنا الريباسي النيوكليوتيدات المتضررة من وجود التربتوفان أو سبار.
Discussion
ووصف هذا الإجراء عزلة في هذا التقرير هو تكرار للغاية. للأسف ، لا يمكن وجود قصيرة ببتيديل - tRNAs المنتجة من نفس تسلسل ترجم يمكن تجنبها بسهولة ، مثل ببتيديل - tRNAs قد تتوافق مع 15-20 ٪ من مجموع المواد المعزولة (الشكل 2C). قد تكون هذه الزيادة في تركيز الملوثات عندما استخدمت تركيزات أعلى من مرنا البيوتين المسمى أو عند استخراج خالية من الخلايا المستخدمة قديمة أو أعيد استخدامها عدة مرات. لذا ، فمن المهم جدا للتحكم في جودة وتركيز عناصر في التفاعلات الترجمة المختبر. بدلا من ذلك ، أعادت عالية الكفاءة التجارية خالية من الخلايا مقتطفات المتاحة التي يمكن استخدامها للأغراض نفسها (نظام PURE) 18.
باستخدام هذا الأسلوب ، يتم تضمينها بشكل عشوائي البيوتين - 16 - UMP على طول ومرنا الهدف. هناك احتمال أن بعض ORFs تحتوي على مساحات يوريدين قد أدرجت هذا المعدل في متواليات النوكليوتيدات بهم ، مما يؤثر على ترجمتها. تركيزات النسبية متغير biotin-16-UTP/UTP أن يتم اختبارها خلال تجميعي للمرنا من أجل الحصول على ترجمة أكثر كفاءة. ويمكن استخدام أساليب بديلة لوضع العلامات البيوتين ، واستهداف 5' نهاية ، ونهاية الأكثر استقرارا من mRNAs. يمكن (ط) أن يرفق البيوتين إلى نهاية 5' - مرنا للاستخدام 3' - NH2ATP (3' الأمينية ، 3' - deoxyadenosine ثلاثي الفوسفات) و T4 RNA يغاز 19. يمكن (ب) أن يرفق 5' نهاية البيوتين المسمى قليل النوكليوتيد إلى نهاية 5' - مرنا للاستخدام الحمض النووي الريبي T4 يغاز كذلك 20. يمكن (الثالث) كما في نهاية 3' البيوتين المسمى oligodeoxynucleotides التي تتوافق مع تسلسل تكميلية في نهاية 5' - مرنا من أن تستخدم لعزل المجمعات ترجمة. يمكن أن تعلق هذه oligodeoxynucleotides البيوتين المسمى إلى الشركات الصغيرة والمتوسطة قبل العزلة. في وقت لاحق SMB تعلق على البيوتين المسمى oligodeoxynucleotides يمكن أن تكون مختلطة مع الترجمة خليط التفاعل للسماح لهم التفاعل مع تسلسل مرنا التكميلية. بعد العزلة ، والهجين RNA - DNA المنطقة -- والمنطقة التهجين بين oligodeoxynucleotide البيوتين المسمى وتسلسل مرنا -- يمكن استخدام المتدهورة ريبونوكلياز H ، التي تفصل بين المجمعات المتعثرة من الخرز streptavidin. هذا الأسلوب قد بديلة تسمح لاستخدامها في المجمعات في التحليلات الهيكلية في المستقبل باستخدام أساليب دقة أعلى.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
LRC - V. يرغب في تكريس هذه الورقة لذكرى الدكتور جونسون Adriel دال ، وهو أستاذ الرائع الذي الاولوية رقم واحد كان دائما في تعليم الطلاب. نحن نفتقدك ، Adriel. نحن ممتنون لمورينو جاكلين لمساعدتها في أداء والتجارب المذكورة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة تقدم إلى CY من مؤسسة العلوم الوطنية ، MCB - 0615390 ، وعبر صناديق المبتدئة التي قدمت إلى الصليب الأحمر اللبناني - V من جامعة الاباما في هانتسفيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Magnesium acetate | Fluka | 63049 | |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Ammonium acetate | Fluka | 09688 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma-Aldrich | P9424 | |
| Leupeptin inhibitor | Sigma-Aldrich | L9783 | |
| Taq-DNA polymerase | Stratagene, Agilent Technologies | 201223 | |
| T7 Maxiprep kit | Promega Corp. | P1300 | |
| SMB | Promega Corp. | Z5482 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Group | 1388908 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| PEP | Sigma-Aldrich | P7002 | |
| PK | Sigma-Aldrich | P7768 | |
| Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | |
| Folinic acid | Fluka | 47612 | |
| Spermidine | Fluka | 85558 | |
| tRNA from E. coli | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T5816 | |
| L-amino acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| magnetic separation stands | Promega Corp. | Z5342 |
References
- Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).
- Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).
- Gaynor, M., Mankin, A. S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).
- Polacek, N., Mankin, A. S. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).
- Steitz, T. A. Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target. Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).
- Tenson, T., Mankin, A. Antibiotics and the ribosome. Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).
- Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).
- Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript. J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).
- Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).
- Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Onouchi, H. Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis. Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).
- Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).
- Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).
- Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression. J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).
- Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression. J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).
- Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
- Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).
- Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase. Mol Divers. 4, 187-190 (1998).
