Summary
含新生肽- tRNA的核糖体的生化分析的一个主要障碍已被其他核糖体的存在，在同一样品的核糖体不参与翻译的特定基因序列分析。我们制定了一个简单的方法，净化，完全包含利益的新生肽酰- tRNA，核糖体。
Abstract
近日，有详细的结构和生化研究许多在新生肽合成抗生素抑制蛋白质的合成过程中，发生在核糖体的分子事件。这些抗生素，大多在形成肽- tRNA的监管新生多肽，抑制要么肽键形成或翻译终止1-7。抑制这些事件可以阻止核糖体的运动，这种现象被称为“翻译逮捕”。抗生素或新生肽诱导的翻译逮捕已被证明，以规管在不同的细胞，如细 胞生长，抗生素耐药性，蛋白质易位和细胞的新陈代谢8-13功能有关的基因的表达。如果我们要了解完整的核糖体在翻译的作用，在每一个有机体，抗生素和监管新生多肽如何改变核糖体的功能的知识是必不可少的。
在这里，我们描述了一个简单的方法，可用于净化，专门分析，这些核糖体的翻译一个特定的mRNA，并包含一个特定的肽酰- tRNA 14。这个程序是基于绑定到一个生物素标记的mRNA翻译的核糖体的选择性分离。这些翻译的复合物是分开相同的混合物中的其他核糖体，采用链霉亲顺磁性珠（SMB）和磁场（MF）。合成生物素标记的mRNA为模板，PCR产生的DNA片段，含有T7转录促销员决胜转录使用检测。 T7 RNA聚合酶结合生物素UTP生物素- 16 - UMP;我们的条件下，约10个生物素- 16 - UMP分子纳入600 NT 25％的人民运动联盟的内容表达。这些生物素标记的mRNA分离，并在体外翻译释放因子2（RF2）进行检测耗尽的大肠杆菌菌株，含有野生型或突变核糖体获得的无细胞提取物。核糖体翻译的生物素标记的mRNA序列停滞在终止密码子区域，由于RF2蛋白质，通常完成翻译终止的情况下。孤立和停滞不前的核糖体含有新合成的肽酰- tRNA从翻译使用SMB的中频反应中删除。这些珠子只能绑定含生物素的消息。
隔离，平移的复合物，可用于分析野生型或突变核糖体元件，或肽- tRNA的序列，以及确定用抗生素或其他分子因素1,14-16核糖体相互作用的结构和功能特性。为了研究这些孤立的核糖体复合体的功能，可以进行肽基转移酶检测在嘌呤霉素的抗生素1存在。要研究翻译复合物的结构变化，以及既定的程序可以使用，如i）交联特定的氨基酸 14和/或ii）烷基化保护分析 1,14,17 。
Protocol
1。无细胞提取物的制备。
- 两克菌体干大肠杆菌获得日志中期阶段文化洗净，两倍半公升的缓冲，一个含有10毫米的Tris -醋酸，pH值8.0，醋酸镁14毫米，60毫米醋酸钾，和50微克/毫升phenylmethanesulphonylfluoride（PMSF）5000 X克离心5分钟，在4 ° C。洗涤后，菌体悬浮于40 mL缓冲液A中
- 使用法国媒体细菌细胞被破坏，采用6000 psi的压力。这种压力相当于600个单位，使用一英寸活塞。中断悬挂收集在一个干净的玻璃管（50毫升）。
- 被视为扰乱悬挂1毫米dithiotreitol（DTT），并在30,000 30分钟XG离心。离心过程是重复的，利用由此产生的上清液。最后上清分装成微管（1毫升）。最后，分装使用干冰乙醇的混合物或液氮冷冻和储存在-60 ° C或-80 ° C。
2。 RF2贫的无细胞提取物的制备。
- RF2在室温下使用一个旋转的轮子，一小时，反抗血清5毫升4.5毫升的蛋白质一个琼脂糖4B浆珠混合。离心混合物是在2500 XG从抗血清中分离出来的珠子。后丢弃上清液，这些珠子含有反RF2抗体（抗- RF2珠）后洗净由再悬浮在1毫升缓冲液B含有35毫米的Tris -醋酸pH值7.8，10毫米醋酸镁，30毫米醋酸铵，60 MM钾谷氨酸和5微克/毫升的亮肽素蛋白酶抑制剂。反RF2珠，然后使用如上所述的相同条件下离心分离缓冲液B。洗涤过程重复两次。
- 一毫升的无细胞提取物混合150μL反RF2珠使用一个旋转的轮子，在4 ° C，为两个小时。万XG混合物离心分离从珠无细胞提取物。上清拆除和处理又与另一反RF2珠150μL。由此造成的无细胞提取液，此过程重复一次。最后的无细胞提取液配发到微管（100μL）。分装是使用干冰乙醇的混合物或液氮冻结，并储存在-60 ° C或-80 ° C。
3。制备的DNA模板。
- 准备1毫升混合包含要翻译的序列的质粒模板（图1）600 femtomoles PCR反应，每个图1中，每一个dNTP的0.2微摩尔和50的U表示的寡核苷酸与0.4纳摩尔的Taq Stratagene公司有限公司提供的缓冲区中的DNA聚合酶执行后续条件下的扩增反应：94℃2分钟，（94 ° 55 ° C 30秒，30秒彗星，72 ° C为1分; 30周期），72 ° C下12分钟。
- 加入1 / 10体积的3 M醋酸钠，pH值5.2，和2卷冰冷的乙醇沉淀的DNA纯化的PCR产品。重复一次降水过程。重悬于100μL二乙基焦碳（DEPC）处理水的DNA。
通常情况下，此过程会产生一个600 bp的DNA产品100微克。 - 验证琼脂糖凝胶电泳PCR产物的完整性。
4。制备生物素标记的mRNA。
- 准备在体外转录反应DEPC处理水，搅拌5微克的PCR产生的DNA片段与0.5微摩尔的ATP，CTP，GTP，0.3微摩尔的生物素- 16 - UTP双绞线，50纳摩尔，和10μL，100 μL， Promega公司提供的缓冲区T7酶混合反应混合物在37 ° C为3小时。
为了量化获得表达量，应该被淘汰的DNA为模板，加入无RNase的DNA酶。孵育反应在37℃10分钟。 - 净化沉淀的RNA，加入1 / 10体积3 M醋酸钠，pH值5.2，冷乙醇和2卷的mRNA的产品。重复一次降水过程。悬浮在100μLDEPC处理水的mRNA。
通常，此过程产生的600 NT素1-2毫克之间标记基因的产品。 - 琼脂糖凝胶电泳验证了生物素标记的mRNA的产品的完整性。
5。含肽酰- tRNA的翻译核糖体的分离。
- 准备500μL的DEPC处理水体外翻译反应混合物搅拌10-15微克生物素标记的基因与75纳摩尔每十九氨基酸以外的所有氨基酸，将改为由放射性氨基酸，50μCi的放射性氨基酸（37MBq），和20-5 0 RF2 -耗尽无细胞提取物在缓冲反应混合物含有pH值8.0的Tris -醋酸，40毫米，10毫米醋酸镁，醋酸钾175毫米，10毫米醋酸铵，数码地面电视的2毫米，2毫米的ATP，0.5μL的，毫米GTP，30毫米磷酸（PEP），0.3 U / mL的丙酮酸激酶（PK），3.5％聚乙二醇8000，1毫米的精胺，20μg/ mL的叶酸和250微克/毫升的 tRNA从E 大肠杆菌 。反应混合物在37℃，10分钟。
除了反应元件的顺序是非常重要的。混合无细胞提取物，必须先用缓冲液中的氨基酸和最终的混合物在室温下5分钟孵育允许核糖体的激活解决方案。后来，加入生物素标记的mRNA。对于使用化学改性过程的结构分析，增加了放射性氨基酸并不是必需的。 - 添加到翻译反应混合物 - 3毫升顺磁性悬浮在缓冲液C含有pH值8.0的Tris -醋酸，35毫米，10毫米醋酸镁，醋酸钾175毫米，10毫米醋酸铵和1毫米的DTT和素珠（SMB）。新的悬挂在室温下孵育10分钟。
- 应用磁场（MF），利用磁选站，从混合物分离的中小企业。
- 悬浮在缓冲液C的SMB和单独的珠子，再次使用的MF。重复此洗涤过程两次。在500μL缓冲液C中重悬珠，储存在冰暂停，并立即执行下一个步骤。
6。隔离含有肽酰- tRNA的核糖体的分析。
对于肽酰- tRNA
- 混合使用10μL含50毫米的Tris - HCl，pH为6.8，2.5％（V / V）甘油，4％的十二烷基硫酸钠，2毫米数码地面电视和0.2毫克的缓冲区装载10μL的SMB（悬浮在缓冲液C） / mL的溴酚蓝。解决运行10％的Tris -甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶样本珠的组件。
- 使用真空凝胶干燥机，干凝胶。
- 验证由一个X光片露出了干凝胶的肽酰- tRNA的完整性和净化。
核糖体RNA
- 2毫米乙二胺四乙酸（EDTA）解决方案，准备用DEPC处理过的的水，加入190μL和200μL苯酚与水平衡，以10μL珠悬挂。严厉震荡混合悬挂和无机相通过离心分离有机相在室温下3分钟在万XG。收集在一个新的微管上的水层。
- 水层的RNA沉淀，加入1 / 10体积的3 M醋酸钠，pH值5.2，1μL20毫克/毫升的肝糖原的解决方案，冰冷的乙醇和2卷。在10μLDEPC处理过的水重悬的RNA。
- 验证琼脂糖凝胶电泳的核糖体RNA的完整性。
通常情况下，50珠悬浮液产生的核糖体RNA1μg。
7。代表性的成果：
图2给出了一系列的评估的质量和使用的程序隔离的翻译核糖体的功能概述分析结果。聚丙烯酰胺凝胶中解决了一个独特的乐队的观察结果显示，势必生物素标记的SMB（图2A）mRNA的的多肽存在。核糖体RNA的纯化，使用此程序建立，以及绑定到这些生物素标记的mRNA（图2B）的核糖体的存在。除了 对嘌呤霉素，抗生素，诱导核糖体肽基转移酶活性，在新生肽- tRNA的1乳沟的结果。这是观察在聚丙烯酰胺凝胶中分离出的多肽（图2C）的迁移模式的转变。总之，这些数据表明，生物素标记的连接到SMB的mRNA含有肽酰- tRNA的功能核糖体。
含有特定的肽- tRNA的翻译核糖体的隔离，允许肽基tRNA基因，抗生素，和其他分子的影响的研究，对核糖体的功能（图3A），核糖体的结构（图3B）。在这里介绍的例子抗生素sparsomycin和氨基酸色氨酸（Trp）抑制在孤立的核糖体（图3A）RF2新生tnaC - tRNA的肽酰- tRNA诱导水解断裂。 sparsomycin或色氨酸与核糖体的相互作用也导致一些核苷酸构成的翻译核糖体（图3B）的23S rRNA的结构变化。总之，这里描述的生物材料，获得使用过程中获得额外的参与抑制核糖体功能后，其与各种分子因素之间的相互作用的结构接触了解的是有用的。
ove_content“>
图1，用于生产和净化翻译核糖体含有肽酰- tRNA的的过程。 DNA片段CA。 650 bp的长度，包含tnaC基因及其邻近地区，如图所示，在准备的mRNA含有生物素，（生物）人民运动联盟]的mRNA作为模板。这些DNA片段是由使用在图上方指出的寡核苷酸的PCR扩增程序。下划线的字母标记在核苷酸引物编码的T7启动子的位置。粗体字母表示的服务Dalgarno序列tnaC mRNA序列的翻译。 T7启动子的DNA片段是公认的T7 RNA聚合酶是用来抄写（箭头）tnaC序列和非编码序列下游。终止时，RNA聚合酶到达后的rpoBC终止序列（rpoBC“T”）的3' -末端的DNA片段，的转录。茎环结构的rpoBC终止保护的mRNA的3' - 5'的exoribonuclease活动目前使用的无细胞提取物在体外翻译反应。隔离（生物）人民运动联盟]的mRNA被用来产生停滞，翻译的核糖体， 在体外翻译实验中使用。 tnaC序列[（生物）人民运动联盟] mRNA的摊位被纳入最后的氨基酸时，由于没有释放因子（RF2）从反应混合物中核糖体翻译。核糖体（生物）人民运动联盟] mRNA的复合物从总的反应链霉亲和磁性珠（SMB）将生物素标记的mRNA中的核苷酸的混合物中分离。中小企业势必给核糖体[（生物）人民运动联盟]通过使用一个磁场（MF），从总的反应混合物中提取mRNA的复合物。
图2。孤立的复合物的结构和功能分析。 A） 在体外翻译反应与执行[（生物）人民运动联盟] tnaC基因的起始密码子是由一个终止密码子的mRNA 。最终产品的使用链霉亲和素磁珠分离，如在图1所示。反应产物和孤立分子，然后由聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。 tnaC - tRNA和tnaC肽带标记。 b）总RNA的提取用酚的提取程序从停滞不前的复合物。每个分离出的RNA琼脂糖凝胶电泳解决。核糖体RNA（rRNAs）表示。三）隔离的复合物含有tnaC - tRNA的培养（+）或无（ - ）0.02毫米嘌呤（普罗）在室温为10分钟。 tnaC肽被打成期间使用[35S] -蛋氨酸（A）或[3H] -脯氨酸（二）翻译。
图3含有tnaC氨酰- tRNA绑定到的抗生素sparsomycin，或色氨酸的核糖体的结构和功能分析。一）含有tnaC - tRNA的隔离复合物孵育（+）或无（ - ）sparsomycin（SPAR）或色氨酸（TRP）在室温5分钟。后来，混合物的混合与RF2和孵育20分钟在37 ° C。二）在23S rRNA基因甲基化的改变分析诱导分子内的核糖体具有约束力。隔离的复合物预培养（+）或无（ - ）2毫米色氨酸或思达为5分钟，在37 ° C。然后，烷基化剂，硫酸二甲酯，是补充和混合物在室温下放置一个额外的20分钟。提取总RNA和引物延伸分析[32P标记的寡核苷酸互补的间距下游100核苷酸的修饰核苷酸的23S rRNA基因的核苷酸。扩展实验的最终产品聚丙烯酰胺凝胶电泳解决。色氨酸或思达存在影响的23S rRNA基因核苷酸表示。
Discussion
这本报告中所述的分离过程是高度重现。不幸的是，从相同的翻译序列产生的短肽- tRNA的存在，不能方便地避免这样的肽- tRNA的可能对应到15-20％的总绝缘材料（图2C）。这些污染物的浓度可能会增加，较高浓度的生物素标记基因已被用于或时无细胞提取物的使用旧的或已重复使用多次。因此，它是非常重要的控制组件的质量和浓度在体外翻译反应。另外，高效率的商业重组的无细胞提取物可以用于同样的目的（纯系统）18 。
使用这种方法，生物素- 16 - UMP是随机纳入沿靶mRNA的长度。有一个可能性，可能有一些的ORF含有尿苷大片纳入这个修改过的核苷酸序列，影响他们的翻译的。 biotin-16-UTP/UTP变量的相对浓度测试，以获取最高效的翻译过程中的mRNA的合成。可以用生物素标记的替代方法，针对5' -端，最稳定的mRNA结束。 （一）生物素可以连接到使用3' - NH2ATP（3' -氨基，3' -脱氧腺苷三磷酸腺苷）和T4 RNA连接酶 19的mRNA的5 '端。 （二）5'端生物素标记的寡核苷酸，可连接使用T4 RNA连接酶的基因， 以及 20的5'端。 （三）3' -末端生物素标记的寡核苷酸对应的mRNA的5'端的互补序列，也可以用来隔离翻译复合物。这些生物素标记的寡核苷酸，可以连接到SMB前隔离。后来的SMB连接生物素标记的寡核苷酸，可以允许与他们互补的mRNA序列互动的翻译反应混合物混合。隔离后，混合RNA - DNA区 - 和地区之间的生物素标记的寡核苷酸与mRNA序列杂交 - 核糖核酸酶H可降解，分离从链霉珠陷入僵局的复合物。这种替代方法可能会允许复合物，在未来的结构分析，使用更高分辨率的方法聘用。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
法改会- V的。希望本文献给博士Adriel D.约翰逊，一个美妙的教授，其的首要任务是对学生的教育内存。我们想念你，Adriel。我们感谢杰奎琳莫雷诺，她在协助执行在这项研究中中所描述的实验。支持这项研究是从美国国家科学基金会，MCB - 0615390至CY提供赠款，并到LRC - V提供的启动资金。在亨茨维尔的阿拉巴马大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Magnesium acetate | Fluka | 63049 | |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Ammonium acetate | Fluka | 09688 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma-Aldrich | P9424 | |
| Leupeptin inhibitor | Sigma-Aldrich | L9783 | |
| Taq-DNA polymerase | Stratagene, Agilent Technologies | 201223 | |
| T7 Maxiprep kit | Promega Corp. | P1300 | |
| SMB | Promega Corp. | Z5482 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Group | 1388908 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| PEP | Sigma-Aldrich | P7002 | |
| PK | Sigma-Aldrich | P7768 | |
| Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | |
| Folinic acid | Fluka | 47612 | |
| Spermidine | Fluka | 85558 | |
| tRNA from E. coli | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T5816 | |
| L-amino acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| magnetic separation stands | Promega Corp. | Z5342 |
References
- Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).
- Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).
- Gaynor, M., Mankin, A. S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).
- Polacek, N., Mankin, A. S. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).
- Steitz, T. A. Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target. Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).
- Tenson, T., Mankin, A. Antibiotics and the ribosome. Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).
- Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).
- Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript. J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).
- Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).
- Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Onouchi, H. Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis. Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).
- Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).
- Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).
- Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression. J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).
- Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression. J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).
- Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
- Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).
- Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase. Mol Divers. 4, 187-190 (1998).
