Summary
يمكن عزل الخلايا الظهارية الرئوي من الجهاز التنفسي لدى الفئران وتربيتها في الهواء السائل واجهة كنموذج للظهارة تنفسية مختلفة. يوصف بروتوكول للعزل ، زراعة وتعريض هذه الخلايا لدخان السجائر العادية ، من أجل دراسة الاستجابات الجزيئية لهذا السم البيئية.
Abstract
يمكن عزل الخلايا الظهارية الرئوي من الجهاز التنفسي لدى الفئران وتربيتها في الهواء السائل واجهة (علي) كنموذج للظهارة تنفسية مختلفة. يوصف بروتوكول للعزل وتعريض هذه الخلايا لدخان السجائر التيار (CS) ، من أجل دراسة استجابات الخلايا الظهارية التعرض CS. بروتوكول يتكون من ثلاثة أجزاء : عزل الخلايا الظهارية من القصبة الهوائية فأرة ، وزراعة هذه الخلايا في الهواء السائل واجهة (علي) الخلايا الطلائية ومتباينة تماما ، وإيصال التيار CS معايرة لهذه الخلايا في الثقافة. نظام يسمح للثقافة علي ثقافة ظهائر الجهاز التنفسي في ظل ظروف أكثر شبها من محيطهم الفسيولوجية العادية نظم ثقافة السائل. دراسة الاستجابات الخلوية الجزيئية والرئة والتعرض CS هو عنصر حاسم لفهم الأثر البيئي لتلوث الهواء على صحة الإنسان. قد نتائج البحوث في هذا المجال أن تسهم في نهاية المطاف نحو فهم مسببات مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، وغيرها من الأمراض ذات الصلة بالتبغ ، والتي تمثل مشاكل صحية عالمية رئيسية.
Protocol
بروتوكول الشاملة يتطلب 2 أيام العزلة عن خلية من أنسجة الحيوانات ، 5-10 أيام لتكاثر الخلايا ، ومبلغا إضافيا 10-14 يوما لتمايز الخلايا في الهواء السائل واجهة. مطلوب يوما اضافيا للتعرض الخلية والحصاد من العينات.
1. عزل الخلايا الظهارية الرغامية ماوس (MTEC).
ملاحظة : لقد تم استعراض جميع الإجراءات المذكورة أدناه والتي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في بريغهام ومستشفى النساء / كلية الطب في جامعة هارفارد المنطقة.
قبل البدء :
- هام في إعداد وسائل الإعلام التي تحتوي على المضادات الحيوية F12. الى 250 مل هام في وسائل الاعلام F12 القاعدية (Cellgro) إضافة 2.50 مل من البنسلين X 100 / الستبرتوميسين (10 2 U/mL-10 2 ملغ / مل) و 250 ميكرولتر حل من حل Fungizone 1000 X. المحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
- يعد حل Pronase 0.15 ٪. إضافة Pronase 15 ملغ إلى 10 مل من وسائل الإعلام F12 هام الذي يحتوي على المضادات الحيوية. جعل الطازجة والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
- إعداد سطح العمل نظيفة ومعقمة الأدوات الجراحية المناسبة لجراحة الحيوانات الصغيرة ، وزراعة الأنسجة صفاحي هود عن العزلة الخلية. وتعتبر جميع الأجهزة الأخرى القياسية لزراعة الخلايا الحيوانية بما في ذلك حاضنات مرطب 2 CO ، غرفة باردة ، الخلية منضدية أجهزة الطرد المركزي ، مجهر مقلوب ، وماصة البلاستيكية والأدوات الثقافة.
- إعداد الكولاجين أنا الحل (50 ميكروغرام / مل في 0.02 ن حمض الخليك). ماصة الكولاجين 1.0 مل الحل في كل بئر من 12 لوحة transwell جيدا (كورنينج). التفاف في parafilm واسمحوا الوقوف بين عشية وضحاها على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام الماوس سلالة المتاحة تجاريا (أي C57Bl / 6 ، 6-8 أسابيع من العمر من الذكور) ، الموت ببطء الفئران باستخدام أسلوب معتمد للقتل الرحيم ، مثل ثاني أكسيد الكربون الناجم عن 2 الخدر. عادة ما سوف تسفر 6 الفئران خلايا كافية (1،5-2،0 5 × 10 خلية / الماوس) على البذور لوحة transwell 12 - جيدا.
- رش جثث الحيوانات مع الحل EtOH 70 ٪ لتعقيم الميدان.
- مع مقص الجراحية النظيفة ومشرط ، وإزالة الجلد حول منطقة القصبة الهوائية ، وفضح القصبة الهوائية. فتح البطن ، وقطع على طول القص وإزالة القفص الصدري. إزالة الأنسجة حتى يتم كشفها نهاية القصبة الهوائية.
- القصبات مكان في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل هام في وسائل الاعلام F12 تحتوي على مضادات حيوية ، على الجليد.
- في غطاء تدفق صفاحي عقيمة ، ونقل أنسجة القصبة الهوائية إلى 100 مم العقيمة طبق بتري تحتوي على 10 مل هام في F12 وسائل الإعلام التي تحتوي على المضادات الحيوية.
- تشريح النسيج الضام بلطف مع ملقط معقم والمقص الجراحي.
- القصبة الهوائية لنقل أنسجة جديدة طبق بيتري 100 ملم تحتوي على 10 مل هام في وسائل الاعلام F12 تحتوي على مضادات حيوية لشطف. قطع القصبات طول المحور الرأسي للكشف التجويف.
- نقل القصبات إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من محلول Pronase 0.15 ٪ ، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في اليوم الثاني ، وجاهز :
- يعد الحل الأول الدناز. إلى 18 مل من وسائل الإعلام F12 هام الذي يحتوي على المضادات الحيوية إضافة 2 مل من 10 ملغ / مل مصل الزلال البقري حل سهم (BSA) ، و 10 ملغ من الخام البنكرياس الدناز أولا جعل aliquots 1 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية (على إذابة الثلج قبل الاستخدام).
- هام في إعداد وسائل الاعلام F12 تحتوي على مضادات حيوية مع 20 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). الى 200 مل هام في وسائل الاعلام F12 القاعدية (Invitrogen) إضافة 50 مل FBS الحرارة المعطل ، و 2.5 مل من البنسلين X 100 / الستبرتوميسين (10 2 U/mL-10 2 ملغ / مل) حل ، و 250 ميكرولتر من حل Fungizone 1000 X .
- إعداد MTEC متوسطة الأساسية التي تحتوي على المضادات الحيوية. إلى 475.5 مل DMEM/F12 سائل الإعلام الأساسية (Cellgro) إضافة 7.5 مل من محلول HEPES 1 م و 10 مل من 200 ملي حل الجلوتامين ، 2 مل من محلول 7.5 ٪ NaHCO 3 ، 5 مل من البنسلين X 100 / حل الستربتوميسين ، 500 ميكرولتر حل Fungizone 1000 X
- إعداد MTEC medium/10 FBS ٪. إلى 45 مل من المتوسط MTEC الأساسية التي تحتوي على المضادات الحيوية ، وإضافة 5 مل FBS الحرارة المعطل.
- صخرة بلطف الأنبوب (من الخطوة 1.8) 10-12 مرات ، ومن ثم السماح لها الوقوف ل30-60 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 10 مل هام في وسائل الاعلام F12 تحتوي على 20 ٪ FBS والمضادات الحيوية في أنبوب والصخور 12 مرة.
- إعداد 3 15 مل تحتوي على أنابيب مخروطية 10 مل هام في وسائل الاعلام F12 تحتوي على 20 ٪ FBS والمضادات الحيوية.
- إزالة القصبات من حل Pronase ، ووضع جانبا هذا الحل على الجليد. نقل القصبات إلى أنبوب مخروطي الشكل الأول الذي يحتوي F12 هام وعكس أنبوب 12 مرة. تكرار هذه العملية مرتين أخريين.
- الجمع بين الحل Pronase supernatants مع ثلاثة من خطوة الى 1.13 مل 50 أنبوب واحد. رفض الأنسجة المتبقية.
- الطرد المركزي في 1400rpm (390 XG ؛ إيبندورف 5810R الطرد المركزي مجهزة الدوار A - 4 - 62) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية ، وتجاهل طاف.
- resuspend بلطف بيليه في حل الدناز 1 مل (100-200 ميكرولتر / القصبة الهوائية)واحتضان 5 دقائق على الجليد.
- الطرد المركزي في 1400rpm (390 x ج) لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتجاهل طاف.
- Resuspend الكرية خلية في المتوسط 8 MTEC مل تحتوي على 10 ٪ FBS
- تعليق لوحة على خلية لوحات Primaria (فالكون). احتضان عند 37 درجة مئوية في جو من الهواء بنسبة 95 ٪ ، 5 ٪ CO 2 لمدة 5 ساعات (ملاحظة : هذه خطوة سلبية لاختيار الخلايا الليفية).
- جمع التعليق الخلية من لوحات لوحات وشطف مرتين مع 4 مل تحتوي على 10 ٪ MTEC FBS. تجمع تعليق الخلية ويغسل معا في أنبوب مخروطي 50 مل.
- 1 مل من أجل الحفاظ على cytospin والفرز الخلية. تدور في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق في 5000 دورة في الدقيقة (إيبندورف 5415D). إزالة 500 ميكرولتر وبيليه طاف في resuspend المتبقية. استخدام 100 ميكرولتر لفرز الخلايا باستخدام أسلوب التلوين التريبان الأزرق الحيوية. 4 الحفاظ على aliquots من 100 ميكرولتر لتحليل cytospin
- تدور المتبقية الخلية 15 مليلتر التعليق على 1400rpm (390 x ج) ، في 4 لمدة 10 دقيقة درجة مئوية.
2. إكثار والتمييز بين MTEC في الهواء السائل واجهة
تحضير حامض الريتينويك الحلول الأسهم. محلول المخزون ج : زن حمض الريتينويك في الظلام (السيد 300.44 غ / مول) لجعل مخزون 5 مم في حل EtOH 95 ٪. مخزن في أنبوب ملفوفة في احباط -80 درجة مئوية. حسب الحاجة ، وإعداد ألبوم باء حل (5 ميكرومتر) وذلك بإضافة 50 ألف سهم ميكرولتر ، 500 ميكرولتر حل جيش صرب البوسنة (100 ملغ / مل) و 49.5 مل من محلول الملح هانك المتوازن (HBSS). ملفوفة في احباط مخزن في أنبوب -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
إعداد MTEC المتوسطة الانتشار التي تحتوي على حمض الريتينويك. وسائل الإعلام إلى 45.7 مل MTEC القاعدية التي تحتوي على المضادات الحيوية ، إضافة الحرارة المعطل 2.5 مل FBS ، 1 مل حامض الريتينويك ألبوم B ، 250 ميكرولتر حل الأنسولين (2 ملغ الانسولين مل / حمض الهيدروكلوريك في 4 ملم) ، و 250 عامل نمو البشرة ميكرولتر الحل (5 ميكروغرام / مل EGF في HBS تحتوي على 1 ملغ / مل BSA) ، و 200 ميكرولتر استخراج الغدة النخامية البقري (15 ملغ / مل في HBS تحتوي على 1 ملغ / مل BSA) ، 50 حل ترانسفيرين ميكرولتر (5 ملغ / مل ترانسفيرين في HBS تحتوي على 1 ملغ / مل BSA ) ، 50 ذيفان الكوليرا ميكرولتر حل (100 ملغ / مل في HBS تحتوي على 1 ملغ / مل BSA). التصفية النهائية تعقيم إعداد واستخدام وسائل الاعلام داخل 2 يوما من التحضير.
- إزالة حل الكولاجين من لوحات transwell ، دعونا نقف تحت غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق ، وتغسل مع أوقات 2 PBS.
- الطرد المركزي التالي ، resuspend الكرية الخلية في حجم مناسب لانتشار وسائل الإعلام (500 ميكرولتر) لتسهيل الطلاء 7.5 × 10 5 4 -1.0 الخلايا X10 لكل بئر. ماصة 500 خلية ميكرولتر تعليق على سطح الغشاء القمي transwell إدراج البولي. إضافة 1.5 مل من وسائل الاعلام لانتشار مقصورة القاعدية من transwell.
- احتضان ثقافات MTEC مغمورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب الهواء المحتوية على 95 ٪ ، 5 ٪ CO 2 لمدة 7-10 أيام.
- الانتظار ثلاثة أيام قبل ان يغير وسائل الإعلام للمرة الأولى. تغير وسائل الاعلام كل يوم. رصد الثقافات عن طريق التفتيش البصري وقياس المقاومة باستخدام الخلايا بطريق الظهارة إلكترود (EVOM Ohmvoltometer ، الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا).
- عندما تظهر الخلايا الظهارية متكدسة والمقاومة تصل Ω 1000 / سم 2 ، وخلايا مستعدون للتمييز على علي.
- إعداد وسائل الاعلام القاعدية التي تحتوي على MTEC NuSerum 2 ٪. إضافة إلى متوسطة NuSerum MTEC أساسي إلى التركيز النهائي من 2 ٪ V / V. إضافة حمض الريتينويك B الأسهم إلى التركيز النهائي من 1 -7 X 10 م قبل استخدام. إعداد الطازجة واستخدامها داخل 2 يوما.
- السماح للتمييز الخلايا لمدة 10-14 يوما ، عن طريق إزالة وسائل الاعلام قمية واستبدال وسائل الاعلام وسائل الاعلام القاعدية مع 750 ميكرولتر MTEC القاعدية التي تحتوي على 2 ٪ حمض الريتينويك Nuserum و. تغيير وسائل الإعلام القاعدية ، ويغسل الجانب قمية مع MTEC NuSerum تحتوي على 2 ٪ يوميا أخرى.
3. تطبيق دخان السجائر إلى الخلايا الظهارية مثقف
- كشف الجانب قمية الثقافات transwell لدخان السجائر تعميم استخدام نظام CS تعرض الخلية (EMI الآلات ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا). انظر الشكل رقم 1 لصورة الجهاز. انظر الجدول الكواشف والمعدات الخاصة للمواصفات الفنية. باختصار ، ويتألف الجهاز من مضخة تمعجية الذي يدخن سيجارة في كل نفث 7-8 ~ ، الرسم في دخان التيار الرئيسي في خط البولي بروبلين التي يتصل بها غرفة التعرض تنفيس. الحفاظ على التعرض في غرفة 37 درجة مئوية خلال تعميم المياه ، والحفاظ على جو من 5 ٪ CO 2 على خط الغاز. يمكن أن تتعرض الخلايا لاستخدام الدخان كنتاكي مرجعية بحثية 3R4F السجائر تصفية (التبغ ومعهد البحوث في جامعة كنتاكي ، يكسنجتون ، KY). عادة ما تتعرض الخلايا إلى دخان السجائر 1-2 ، والرضوخ 100-200 ملغ / م 3 من الجسيمات الكلية (TPM). ويتعرض لسيطرة الثقافات هواء الغرفة لفترة التعرض ما يعادلها.
- يقاس TPM وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة المتوفرة مع الشركة المصرية للاتصالات- 10C آلة تدخين (الشركات تيج). باختصار ، يتم وضع فلتر (Pallflex) في الفولاذ المقاوم للصدأ حامل مضمنة في أنبوب أخذ العينات من ميناء الرائدة أخذ العينات في غرفة التدخين لمضخة التدفق المستمر (وحدة المعاينة). أنبوب تدفق يربط وحدة المعاينة على الغاز متر (الجاف الغاز متر ، ONM61 ، 67 عاما ، AEM). يتم وزن التصفية قبل وبعد أخذ العينات الغاز. هو تطبيع مجموع المواد تترسب على تصفية في ملغ للحجم الكلي للعينات من الهواء.
- ثم يمكن للخلايا أن تحصد أي نقطة في الوقت (أي 0-24 ساعة) بعد التعرض لمستوى الخلية الإجراءات التحليلية (أي لطخة مناعية الغربية ، تحليل مرنا ، الخ) أو المجهري (أي مبائر المجهري أو الإلكترون). ويمكن أيضا أن تكون وسائل الإعلام الثقافة تحليلها لالسيتوكينات LDH أو الإفراج عن المقايسات السمسة.
4. ممثل النتائج
وينبغي عزل الظهارية ناجحة ، والانتشار ، والتمايز في ALI تسفر عن المونولاير سليمة مع التشكل الحصوه. ينبغي Transepithelilal مقاومة الخلايا للثقافات صحية لا يجوز أن حوالي 1000-2000 Ω / سم 2. الشكل 2 يصور أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية التنفسية الماوس الملون للالخلايا الظهارية وعلامات أهداب في ظل ظروف السيطرة وبعد التعرض لدخان السجائر. ويبين الشكل 3 micrographs الإلكترون ممثل الثقافات MTEC صحية ، والتي تصور الترآيب الدقيق ومورفولوجيا الأهداب.
الشكل 1. إعداد حصيلة الخلايا الظهارية من خلال ثلاث مراحل ، خطوة العزلة ، ومرحلة الانتشار ، ومرحلة التمايز في الهواء السائل واجهة (مخطط). يتم عزل الخلايا الظهارية من القصبة الهوائية الماوس ، المصنفة على transwells حيث تتكاثر في الثقافة المغمورة ، وتحويلها بعد ذلك الى واجهة الهواء السائل حيث تفرق تماما. وتجرى التجارب عادة في اليوم ال 24 للثقافة المستمر. صورة تصور نظام نموذجي للتعرض الخلايا المستنبتة لدخان السجائر العادية. يتم وضع الثقافة علي transwell النظام داخل نظام السجائر وحدات مخصصة تسليم الدخان الذي يسيطر على نسبة الرطوبة ودرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2.
الشكل 2 تم إصلاح الخلايا الظهارية الثقافات والملون للنوى (هويشت 33258) ، F - الأكتين (أخضر ؛ اليكسا - 488 - فلور Phalloidin مترافق). وعلامة أهداب الأسيتيل α - تويولين (أحمر ؛ Cy3 - مترافق الضد الثانوية) السفلي لوحات تظهر الصور ما يعادل الخلايا الظهارية التي اتخذت بعد 4 ساعات من التعرض لدخان السجائر (2 السجائر ، و 150 ملغم / م 3). (ب) وقد تم قياس اللاكتات الديهيدروجينيز (LDH) الإفراج عن المعتقلين في المتوسط القاعدية بعد 24 ساعة من التعرض لجرعات متفاوتة من دخان السجائر كما هو مبين.
الشكل 3. ثقافات واجهة الهواء السائل من الخلايا الظهارية المعزولة من ظهارة الماوس القصبة الهوائية في التفريق فرعية عدة بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) لديها خصائص الخلايا ، مهدبة القاعدية ، وغير مهدبة - 1. هذه الخلايا يصنف ظهارة تنفسية كاذبة. تسميات تتوافق مع الشكل : ب : الجسم القاعدية ، وهو : الخيط المحوري ، م : الميتوكوندريا ، ن : النواة ، ق : الركيزة (البولي الغشاء) ، MV : microvili
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتم تكييف بروتوكول يصف عزل الخلايا الظهارية الماوس القصبة الهوائية من بروتوكولات آخرون لك ، 1 ، وغيرها مع بعض التعديلات 2-3 كما هو الحال مع أي خلية العزلة بروتوكول يصف ، فإن الجانب الأكثر أهمية هو تجنب التلوث من مسببات الأمراض البكتيرية أو الفطرية باستخدام تقنيات العقيم صارمة. والخطوة الثانية الحاسمة في تجنب التلوث الليفية من الثقافات ، والتي يمكن تجنبها من خلال تشريح دقيق للالقصبات ، واختيار سلبية كما هو موضح في الخطوة 1.19. شريطة أن يتم رصد الثقافات ، وغسلها ، ووسائل الإعلام الثقافة تتجدد كل يوم بعد 72 ساعة الأولي الحضانة ، يجب أن نفرق تماما بين الثقافات في ما يقرب من اسبوعين من بدء علي.
مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، الذي سببه التعرض لدخان السجائر المزمنة ، لا تزال تمثل مشكلة صحية عمومية كبرى 4-7. ويتسم هذا المرض ، عن طريق الحد من تدفق الهواء تدريجيا ، فقدان السنخية المدمرة (انتفاخ الرئة) ، والاستجابة للالتهابات في الرئة مبالغا فيه لدخان السجائر 4-7. وقد استخدم عدد كبير من الدراسات ، القصبي السنخي ، ونظم الخلايا الظهارية مجرى الهواء لمحاولة التصدي لنموذج خلية الرئة CS. وقد أجريت العديد من هذه الدراسات في الخلايا الظهارية أو خطوط حولت (أي بيز - 2B) ، راجع الحكام 11/08 للحصول على أمثلة. ثقافة transwell علي نظام يسمح للثقافة الخلايا الظهارية الرئوي في الأزياء التي هي أقرب إلى ميولهم الفسيولوجية في مجرى الهواء ، من تلك التي يمكن أن تقدمها السائل التقليدية (المغمور) 1-3 الثقافة. على الرغم من أن بروتوكول مميزة يصف تطبيق هذا النظام الأساسي على الثقافات الماوس القصبة الهوائية 1 ، من حيث المبدأ يمكن تطبيقه غيرها من الخلايا الظهارية الأولية (أي نوع الماوس الخلايا الظهارية الثاني ، الإنسان الخلايا الظهارية الشعب الهوائية ، الخ). تطبيق CS التيار يعيش على الثقافات الخلية يمثل النموذج الذي ربما يقترب على نحو أوثق تعرض الإنسان لCS من تطبيق استخراج دخان السجائر مائي (CSE) ، والذي يستخدم عادة في الدراسات الخلوية التعرض CS 12-15. CSE يمثل ذوبان جزء من الدخان التيار الذي يفتقر العديد من المكونات الكيميائية من الدخان كله. في حين أن كلا النظامين CS التعرض لها حدود ، CSE لديها ميزة كونها أكثر سهولة معايرتها ، حيث يمكن استخدام مستحضر واحد للتجارب متعددة ، ويتحقق عن طريق تخفيف الجرعات 15-16. من ناحية أخرى ، نحن هنا تشمل طريقة لقياس التيار تسليم الدخان على أساس القياسات TPM. توضيح من الاستجابات الجزيئية والخلوية التعرض للسموم ، ولا سيما CS كما يتضح في هذه المقالة ، سوف مزيد من الفهم لتأثير تلوث الهواء على صحة الإنسان ، وخصوصا مسببات الأمراض المزمنة في الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ايميكا Ifedigbo للحصول على المساعدة التقنية ، والدكتور تياجي شيفراج للخبرات قيمة. كما نشكر مركز هارفارد للحصول على المساعدة NeuroDiscovery مع المجهري. وأيد هذا العمل في جزء من قبل جمعية القلب الاميركية Predoctoral منح 09PRE2250120 للام هيلير ، والمعاهد الوطنية للصحة المنح ، R01 - HL60234 ، R01 - HL55330 ، R01 - HL079904 ، منحت لتشوي AMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
|||
References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
