Summary
肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。
Abstract
肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面（ALI）で培養することができます。プロトコルは、CSの曝露に上皮細胞の応答を研究するために、たばこの主流煙（CS）にこれらの細胞を分離し、公開するために記述されています。マウス気管、気液界面（ALI）として完全に分化した上皮細胞におけるこれらの細胞の培養、及び培養中のこれらの細胞に校正された主流CSの配信から気道上皮細胞の分離：プロトコルは、次の3つの部分から構成されています。 ALI培養系は、より密接に通常の液体培養系よりも生理の設定に似ている条件の下で呼吸上皮の文化を可能にします。 CSの暴露分子と肺細胞応答の研究は、人間の健康に対する環境大気汚染の影響を理解することの重要なコンポーネントです。この分野での研究成果は、最終的に慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および世界の主要な健康上の問題を表す他のタバコ関連疾患の病因の理解に向けて貢献するかもしれない。
Protocol
全体的なプロトコルは、動物の組織、細胞増殖のための5-10日間、および気液界面での細胞分化のための追加10-14日からのセルのアイソレーションのための2日間が必要です。追加日は、セルのエクスポージャーとサンプルの収穫のために必要です。
1。マウス気管上皮細胞（MTEC）の単離。
注：すべての手順以下に説明するがレビューとブリガムアンドウィメンズ病院/ハーバードメディカルスクールのエリアでの動物実験使用の委員会によって承認されている。
始める前に：
- 抗生物質を含むハムF12メディアを準備します。 250mLのハムのF12基礎培地（Cellgro）に100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューションと1000 X Fungizone液の250μLの2.50 mLを加える。 4週間まで4℃で保存する。
- 0.15％プロナーゼの溶液を調製します。抗生物質を含むハムF12メディアを10mLに15 mgのプロナーゼを追加。新鮮確認し、使用するまで氷上に置きます。
- 清潔な作業面と滅菌手術器具小動物の手術のための適切な、およびセルのアイソレーションのためのラメラ組織培養フードを準備します。他のすべての機器は加湿CO 2インキュベーター、寒い部屋、卓上細胞遠心分離機、倒立顕微鏡、および使い捨てのプラスチックピペットと文化のウェアを含む動物細胞培養のための標準と考えられています。
- コラーゲンを準備I溶液（0.02 N酢酸で50μg/ mlの）。 12ウェルトランスウェルプレート（コーニング）の各ウェルにピペットを1.0 mLのコラーゲン溶液。パラフィルムでラップし、室温で平らな面に一晩放置する。
- 市販のマウス系統（すなわち、男性の6-8週間のC57BL / 6、）を使用して、このようなCO 2誘導性昏睡のような安楽死の承認された方法を使用してマウスを安楽死させる。一般的に6匹のマウスは、種子を12穴トランスウェルプレートのに十分な細胞を（1.5〜2.0 × 10 5細胞/マウス）が得られます。
- フィールドを殺菌を70％EtOH溶液で動物の死体を吹き付けます。
- クリーン外科はさみやメスで、気管領域の周囲の皮膚を削除し、気管を公開。腹部を開くと、胸骨に沿って切断し、胸郭を削除します。気管の端が露出するまで組織を削除します。
- 氷の上に、抗生物質を含有する30mLのハムのF12培地を含有する50mLのコニカルチューブに入れます気管。
- 滅菌薄層流フードで、抗生物質を含有する10mLのハムのF12培地を含有する無菌の100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。
- 優しく滅菌ピンセットと手術用はさみで結合組織を細かく分析。
- リンスに抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含有する新しい100ミリメートルシャーレに気管組織を移す。内腔を露出させる縦軸に沿って気管をカット。
- 10 mLの0.15％プロナーゼ溶液を含む50 mLの試験管に気管を移し、4℃で一晩インキュベート℃、
- 二日目に、用意しておいてください。
- DNase I溶液を準備します。に抗生物質を含むハムF12メディアの18 mLのは10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）ストック溶液2 mlを加え、粗膵臓DNase Iの10 mgのは、-20〜1mLのアリコートとストア° Cを（に融解してください使用前に氷）。
- 20％ウシ胎児血清（FBS）と抗生物質を含むハムF12培地を準備。 〜200 mLのハムのF12基礎培地（Invitrogen社）を50mLの熱不活化FBS、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン（10 2 U/mL-10 濃度2μg/ ml）ソリューション、および1000 X Fungizone液の250μLの2.5 mLを加え。
- 抗生物質を含有MTEC基本培地を調製。に475.5 mLのDMEM/F12基本的なメディア（Cellgroは）7.5 mLの1 M HEPES溶液を、200mMのグルタミン溶液を、7.5％NaHCO 3溶液、100 ×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液5 mLを2 mLの10 mLの、500μLを加える1000 X Fungizoneソリューションの
- MTEC medium/10％FBSを準備します。抗生物質を含有MTEC基本培地45 mLに、5mLの熱不活性化FBSを追加。
- ゆっくりと（ステップ1.8から）10-12回チューブを揺すり、そしてそれが4で30〜60分放置℃を
- チューブやロックの12倍に20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムF12メディアを追加します。
- 20％FBSおよび抗生物質を含む10mLのハムのF12培地を含む3 15 mLコニカルチューブを準備します。
- 氷の上でこのソリューションを横に置く、プロナーゼ溶液から気管を外します。ハムのF12を含む最初のコニカルチューブに気管を移し、チューブを12回転倒混和します。このプロセスをさらに2回繰り返します。
- 1つの50 mlチューブにステップ1.13から三上清とプロナーゼ溶液を組み合わせる。残りの組織を捨てる。
- で10分間4℃で、そして上清を捨てる、1400rpm（- 4 - 62ローターを装備したエッペンドルフ5810Rの遠心分離機390 × g）で遠心。
- 静かに1 mLのDNase溶液（100〜200μL/気管）でペレットを再懸濁そして氷上で5分間インキュベートする。
- 4℃で5分間℃で1400rpm（390 × g）で遠心し、上清を捨てる。
- 10％FBSを含む8 mLのMTEC培地中で細胞ペレットを再懸濁します
- Primariaプレート（ファルコン）上にプレートの細胞懸濁液。 37℃95％空気の雰囲気の中でC、5時間（注：これは、線維芽細胞の負の選択のステップである）ため、5％CO 2。
- プレートから細胞懸濁液を収集し、4mLのMTECは、10％FBSを含むで二回プレートをすすぎます。プールの細胞懸濁液と50 mLコニカルチューブに一緒に洗う。
- サイトスピンおよび細胞計数用1 mLを節約する。 5,000 rpmで（エッペンドルフ5415D）で5分間卓上遠心機でスピン。残りの上清に、500μLのペレットを再懸濁しますを削除します。トリパンブルー生体染色法を用いて細胞計数のために100μLを使用してください。サイトスピン分析のために100μLの4アリコートを節約
- 4℃、1400rpm（390 × g）で、残りの15 mLの細胞懸濁液をスピン℃で10分間。
2。気液界面で伝播し、MTECの分化
レチノイン酸のストック溶液を準備します。ストック溶液：95％エタノールに5 mMのストック溶液を作るために暗所でレチノイン酸（ミスター300.44グラム/モル）を秤量。 -80℃ホイル、ラップチューブで℃で保存必要に応じて、50μLの株式を、500μLBSA溶液（100 mg / mLの）と49.5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加することにより、ストック溶液Bを（5μM）を用意。箔の店舗は、4週間まで-80℃でチューブを包んだ。
レチノイン酸を含むMTEC増殖培地を準備します。抗生物質を含む45.7 mLのMTEC基礎培地に、2.5 mLの熱不活化FBS、1 mLのレチノイン酸証券B、250μLインスリン溶液（4mMの塩酸で2 mg / mLのインスリン）、250μL上皮成長因子の溶液（5μgの/を追加します。 1 mg / mLのBSAを含むHBSに溶解EGF）、200μLのウシ下垂体抽出物（HBSでの15 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）、50μLトランスフェリン溶液（HBSで5 mg / mLのトランスフェリン1 mg / mLのBSAを含む）、50μLコレラ毒素の溶液（HBSの100 mg / mLのは、1 mg / mLのBSAを含む）。最終的なメディアの準備を滅菌濾過し、準備の2日以内に使用してください。
- トランスウェルプレートからコラーゲン溶液を除去する、5分間ボンネットの下に放置し、PBSで2回洗浄する。
- 以下の遠心分離は、ウェルあたり7.5 × 10 4 -1.0 × 10 5細胞のプレーティングを容易にするために増殖培地（500μL）の適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。トランスウェルのポリカーボネート膜インサートの先端表面にピペット500μLの細胞懸濁液。トランスウェルの底面コンパートメントに拡散媒体を1.5 ml加え。
- 37℃水中MTECの文化をインキュベートします7〜10日、95％空気、5％CO 2を含む加湿インキュベーターでCを。
- メディアを最初に変更する前に、三日待つ。一日おきにメディアを変更します。電極（EVOM Ohmvoltometer、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州）を用いて上皮細胞の抵抗の目視検査及び測定によって文化を監視します。
- 細胞がコンフルエントに表示され、上皮抵抗が1000Ω/ cm 2のに達すると、細胞がALIで差別化する準備が整いました。
- 2％NuSerumを含むMTEC基礎培地を準備。 2％の最終濃度V / VにMTEC基本培地にNuSerum追加使用する前に、1 × 10 -7 Mの最終濃度にレチノイン酸ストックBを追加。新鮮な準備、2日以内に使用してください。
- 細胞が頂メディアを削除すると2％Nuserumとレチノイン酸を含む750μLMTEC基礎培地と基本培地に置き換えることによって、10〜14日間を区別することができます。基礎培地を変更し、MTECは一日おきに2％NuSerumを含むで頂端側を洗う。
3。培養上皮細胞へのタバコの煙のアプリケーション
- CSの細胞の露光装置（EMIインスツルメンツ、ピッツバーグ、PA）を使用して、たばこの主流煙にトランスウェル培養の先端側を公開します。装置の写真については、図1を参照してください。技術的な仕様については、特定の試薬と機器の表を参照してください。簡単に言うと、装置は、通気曝露チャンバーに接続されているポリプロピレンのラインに主流煙で描く、〜7月8日パフで各タバコを吸う蠕動ポンプで構成されています。暴露室は水を循環させることにより37℃でCを維持し、ガスラインで5％CO 2の雰囲気に維持されている。細胞は、ケンタッキー州3R4Fの研究の参照フィルタタバコを（たばこ総合研究所、ケンタッキー大学、レキシントン、ケンタッキー州）を使用して煙に曝露することができます。一般的に細胞は、全体の粒子状物質（TPM）100〜200ミリグラム/ m 3をもたらし、1-2タバコの煙にさらされています。対照培養物は、同等の露光期間に部屋の空気にさらされている。
- TPMは、TEに付属している製造業者のプロトコルに従って測定され- 10C喫煙のマシン（ティーグの企業）。簡単に言うと、フィルタは（Pallflex）定流量ポンプ（サンプリングユニット）に喫煙室でのサンプリングポートからリードするサンプリングチューブにインラインステンレス製ホルダーに配置されます。流出管は、ガスメータ（乾式ガスメータ、ONM61、67、AEM）にサンプリングユニットを接続します。フィルターは、ガスサンプリングの前後に秤量する。総物質はmgでフィルター上に堆積サンプリング空気の合計量に対して正規化されています。
- 細胞は、任意の時点（すなわち、0〜24時間）スタンダードセル分析手順（すなわち、欧米のイムノブロット分析、mRNAの解析、等）または顕微鏡用露光後（すなわち、共焦点または電子顕微鏡）で収穫することができる。培養培地は、サイトカインや細胞毒性のアッセイのためのLDH放出を分析することができます。
4。代表的な結果
ALIで成功した上皮単離、増殖、及び分化は、石畳の形態で無傷の単分子層を生成する必要があります。健全な文化のTransepithelilalセル抵抗は、約1000から2000Ω/ cm 2とする必要があります。図2は、制御条件の下で、タバコの煙の曝露後の上皮細胞と繊毛のマーカーに染色したマウス呼吸器上皮細胞の単層を示しています。図3は、超微細構造と繊毛の形態を描いた、健康MTEC文化の代表的な電子顕微鏡写真を示しています。
図1三相、単離工程、繁殖の段階、および気液界面（スキーム）で、差別化の段階を通じて、上皮細胞の進行の準備。上皮細胞は、マウス気管から分離彼らは液体培養で増殖transwellsに播種し、彼らは完全に区別する気液界面に変換されます。実験は、通常、連続培養24日目に実施しています。写真は、たばこの主流煙に培養細胞の曝露のためのモデルシステムを示しています。トランスウェルALI培養系は、温度、湿度、CO 2のために制御されているカスタムモジュール式のタバコの煙のデリバリーシステム内に配置されます。
。と繊毛のマーカーアセチル化α-チューブリン（赤、Cy3結合二次抗体）、 図2上皮細胞培養は、F -アクチン（アレクサ- ® 488標識ファロイジン緑）、核（ヘキスト33258）のために固定し、染色した。下のパネルは4時間、タバコの煙への曝露（2本のタバコ、150 mgの/ m 3）の後に採取した上皮細胞と同等の画像を示す。示されているように（B）乳酸脱水素酵素（LDH）放出は、24時間タバコの煙の様々な用量に暴露した後の基礎培地で測定した。
図3マウス気管上皮から分離された上皮細胞の気液界面培養は、透過型電子顕微鏡によって（TEM）繊毛、基底、および非繊毛細胞1の特性を持っているいくつかのサブタイプに分化する。これらの細胞は多列気道上皮を象徴化する。図のラベルはに対応しています：BB：基礎体温、：軸糸、M：ミトコンドリア、N：核、S：基板（ポリカーボネート膜）、MV：microvili
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Discussion
マウス気管上皮細胞の単離を記述するプロトコルは、1、。あなたらのプロトコルから適応、およびその他の変更で2-3。れるセルのアイソレーションを記述する任意のプロトコルと同様に、最も重要な側面は、厳格な無菌操作を用いて、細菌または真菌病原体からの汚染を避けるためです。 2番目に重要なステップは、ステップ1.19で説明されているように線維芽細胞の気管を慎重に解剖することによって回避できます文化の汚染、および負の選択を避けるためです。文化は、監視洗浄し、そして培養培地は、初期72時間のインキュベーション後の一日おきに補充されていれば、文化は完全にALIの開始から約2週間で区別する必要があります。
主に慢性的なたばこの煙の曝露によって引き起こされる慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、、世界の主要な健康上の問題4-7を表現し続けています。 COPDは、進行性の気流制限、破壊的な肺胞の損失（肺気腫）、及びタバコの煙4-7肺の誇張された炎症反応によって特徴づけられる。多くの研究では、CSにモデルの肺細胞の応答を試みるように肺胞、気管支、および気道上皮細胞のシステムが使われてきました。これらの研究の多くは、上皮細胞または形質転換線（すなわち、BEAS - 2B）で行われている、文献例8-11を参照してください。 ALIトランスウェル培養系は、培養1-3（水中）、従来の液体により提供できるものではなく、気道におけるその生理的方向に近い方の方法で肺上皮細胞の培養が可能になります。機能のプロトコルがマウス気管初代培養1〜このシステムの応用について説明していますが、原理的には他の主要な上皮細胞（すなわち、マウスのタイプII上皮細胞、ヒト気管支上皮細胞、など）を適用することができます。細胞培養へのライブ主流CSのアプリケーションは、おそらくもっと密接に一般的にCSの曝露12〜15の細胞の研究で用いられる水性タバコの煙抽出物（CSE）、のアプリケーションよりもCSへのヒトの暴露を近似するモデルを表しています。 CSEは、全体の煙の多くの化学成分を欠いている主流煙の可溶性画分を表します。両方のCSの露光装置には限界がある一方、CSEは、単一の製剤が複数の実験のために使用することができる、と投薬を希釈15から16によって達成されるので、より簡単に、キャリブレーションされているという利点があります。一方、我々はここでTPM測定値に基づいて、主流煙の配信を定量化する方法が含まれています。毒素の暴露への分子と細胞応答の解明は、特にCSは、この記事で例示される、肺の慢性疾患の病因、特に、ヒトの健康上の大気汚染の影響の理解を深めるだろう。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、貴重な専門知識のための技術支援と博士Shivraj TyagiためEmeka Ifedigboに感謝。我々はまた、顕微鏡の支援のためにハーバードのNeuroDiscoveryセンターに感謝します。この作品は、イレールラム、およびAMK崔に贈られるNIHの助成金、R01 - HL60234、R01 - HL55330、R01 - HL079904に許可を09PRE2250120博士号を取得する前のアメリカ心臓協会によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
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References
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