Summary
Whole mount
Abstract
Whole mount in situ Hybridisierung (WISH) ist eine verbreitete Technik in molekularbiologischen Laboratorien verwendet werden, um die Genexpression durch die Lokalisierung von spezifischen mRNA-Transkripte innerhalb der gesamten Probe aufsetzen zu studieren. Diese Technik (in Anlehnung an Albertson und Yelick, 2005) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer an der Syracuse University verwendet. Die ersten zwei Drittel des Comparative Biology Vertebrate Praktikum gab Studenten die Möglichkeit, der Embryologie und der makroskopischen Anatomie von mehreren Organismen, die verschiedene chordate Taxa in erster Linie über traditionelle Sezieren und die Verwendung von Modellen zu studieren. Der letzte Teil des Kurses beteiligt einen innovativen Ansatz zur Lehre Anatomie durch Beobachtung der Entwicklung von Wirbeltieren beschäftigt molekulare Techniken, bei denen Wunsch auf Zebrafisch-Embryos durchgeführt wurde. Eine heterozygote Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 a (fgf8a) Mutantenlinie, ace, verwendet wurde. Aufgrund Mendelschen Vererbung, Kreuzungen ace produziert Wildtyp, heterozygot und homozygot ace/fgf8a Mutanten in einer 1:2:1-Verhältnis. RNA-Sonden mit bekannten Expressionsmuster in der Mittellinie und in der Entwicklung anatomischen Strukturen wie Herz, Somiten, tailbud, Myotom und Gehirn verwendet. WISH wurde mit Zebrafisch auf den 13 Somiten und prim-6 Stufen, mit Studenten der Durchführung der Farbreaktion in der Klasse. Die Studie des Zebrafisch-Embryos in verschiedenen Stadien der Entwicklung gab den Studierenden die Fähigkeit zu beobachten, wie diese anatomischen Strukturen über Ontogenese verändert. Darüber hinaus zeigten einige ace/fgf8a Mutanten unsachgemäße Herzen Looping und Mängel in Somiten und die Entwicklung des Gehirns. Die Schülerinnen und Schüler in diesem Labor beobachtet die normale Entwicklung der verschiedenen Organsysteme mit beiden äußeren Anatomie sowie Genexpressionsmuster. Darüber hinaus identifiziert und Embryonen Anzeige falsche anatomische Entwicklung und Genexpression (dh, putative Mutanten) beschrieben.
Für Lehrer an Institutionen, die nicht bereits über die erforderlichen Geräte oder wo die Mittel für Labor-und curriculare Innovation beschränkt sind, können die finanziellen Kosten für die Reagenzien und Geräte ein Faktor zu betrachten, da wird die Zeit und Mühe auf den Teil der benötigten Lehrer unabhängig von der Einstellung. Trotzdem behaupten wir, dass die Verwendung von WISH in dieser Art von Unterricht im Labor Einstellung kann ein wichtiges Bindeglied zwischen Entwicklungsgenetik und Anatomie bieten. Die Entwicklung schreitet voran und die Fähigkeit zur organismischen Entwicklung auf molekularer Ebene Studie wird einfacher, billiger und immer beliebter, viele Evolutionsbiologen, Ökologen und Physiologen Forschungsstrategien im Bereich der Molekularbiologie drehen. Mit WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer ist ein Beispiel dafür, wie Moleküle und Anatomie kann in einem einzigen Kurs zusammen. Dies gibt oberen Ebene College-Studenten die Möglichkeit, moderne biologische Forschung Techniken, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung der Praxis.
Protocol
1. Plasmid Transformation von Target-cDNA
Teil I: Die Transformation von Plasmid
(Zeitaufwand: 3 Stunden plus Inkubation über Nacht)
- Warm SOC Nährlösung in einem 42 ° C Wasserbad (500 ul pro Reaktion)
- Thaw kompetenten Zellen auf Eis
- Add 1 ul Plasmid auf 25 ul kompetenten Zellen
- Auf Eis für 20 Minuten
- Hitzeschock-Zellen in 42 ° C Wasserbad für 45 Sekunden
- Unmittelbar Ort Zellen auf Eis für 2 Minuten
- Add 500 ul von 42 ° C Nährbouillon in jedes Fläschchen von Zellen
- Schütteln bei 37 ° C für 2 Stunden bei 255 Umdrehungen pro Minute (rpm)
- Tafel 75 ul Transformation Mix auf Luria Bertani (LB) Agarplatten
- Die Platten bei 37 ° C über Nacht invertiert
Teil II: E. coli Kultur
(Zeitaufwand: 15 Minuten plus Inkubation über Nacht)
- Für jede Reaktion Aliquot 3 ml LB-Bouillon und 3 ul 50 mg / mL Ampicillin in einer Kultur Rohr
- Scrape 1 Bakterien Kolonie von der Agarplatte und fügen Sie jede Kultur Rohr
- Schütteln Sie Kulturröhrchen bei 37 ° C bei 255 rpm über Nacht
Teil III: Plasmid Prep
(Zeitaufwand: 1,5 Stunden)
- Isolieren von Übernacht-Kulturen mit dem 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Katalog Nr. 2300000) Plasmid
- Um zu überprüfen, auf die Anwesenheit von Plasmid vorbereitet, führen Sie die DNA aus dem Kit auf einem 1% Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt eluiert
2. In Situ DIG-markierten RNA-Sonde Synthese
Teil I: Linearisierung der Plasmid
(Zeitaufwand: 2,5 Stunden)
- In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren:
Vorbereitet Plasmid 20 mL Restriction Enzyme * 2 mL Buffer ** 10 mL 10X Bovine Serum Albumin (BSA) 10 mL Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser 58 mL 100 mL - Bei 37 ° C für 2 Stunden
* Variiert mit Plasmid
** Variiert mit dem Restriktionsenzym
Teil II: Transkription
(Zeitaufwand: 3 Stunden)
- In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren:
Linear Plasmid 4 mL 10X Transcription Buffer ** 4 mL Digoxigenin Label Mix 4 mL Polymerase * 2 mL RNase-Inhibitor 2 mL DEPC Wasser 24 mL 40 mL - Bei 37 ° C für 1 Stunde
- Add 2 ul der Polymerase *
- Bei 37 ° C für 1 Stunde
- Add 2 &mgr; l DNase
- Bei 37 ° C für 20 Minuten
* Variiert mit Plasmid
** Variiert mit Polymerase
Teil III: Niederschlag
(Zeitaufwand: 5 Minuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und resuspendieren)
- Add 4 ul 0,2 M EDTA
- Add 5 ul 4M Lithiumchlorid
- Fügen Sie 150 ul eiskaltem 100% Ethanol
- Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht
- Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand
- Dry Pellet für 7 Minuten
- In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend
- Bei 37 ° C für 5 Minuten
Teil IV: Die Fraktionierung - Führen Sie nur, wenn Sonde größer ist als 0,6 kb
(Zeitaufwand: variiert je nach Sonde Größe, in der Regel nicht mehr als 20 Minuten)
- In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren:
RNA-Sonde 20 mL DEPC Wasser 12 mL Natriumbikarbonat 4 mL Sodium Carbonate 4 mL 40 mL - Inkubieren in einem 60 ° C Wasserbad. Basis der Inkubationszeit auf die Gleichung:
Dauer (Min.) = (ab kb - gewünschte kb) / (.11 x beginnend kb x gewünschte kb)
Durchschnittliche gewünschte Größe = 0,6 kb
Teil V: Final Niederschlag
(Zeitaufwand: 5 minnuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und wieder auszusetzen, 1 Stunde für die Gel-Elektrophorese)
- Zugabe von 40 ul DEPC-Wasser
- Add 8 &mgr; l Natriumacetat
- Add 1,04 ul Eisessig
- Add 240 &mgr; l eiskaltem 100% Ethanol
- Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht
- Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand
- Dry Pellet für 7 Minuten
- In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend
- Vortex mischen
- Um zu überprüfen, auf das Vorhandensein von Ribosonde, führen Sie den resuspendierten Lösung auf einem 1% TAE-Gel mit Ethidiumbromid angefärbt
3. Whole mount in situ Hybridisierung
Teil I: Fixation des Embryos und Proteinase K Verdau
(Zeitaufwand: Fix Nacht plus 4 Stunden am nächsten Tag für die Lagerung, 2,5 Stunden von der Lagerung bis Part II)
- Sammeln Sie inszeniert Zebrafischembryonen und fix in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C
- Wash festen Embryonen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (PBST) 3 mal für jeweils 10 Minuten
- Um das Risiko der Embryonen in die experimentelle Reagenzien, manuell dechorionate Embryonen (falls erforderlich) mit spitzen Pinzette zu gewährleisten
- Entwässern Embryonen durch Waschen in einer abgestuften Reihe von 25% und 50% Methanol in PBST für jeweils eine Stunde zu waschen, dann in 100% Methanol bei -20 ° C
- Wenn Sie bereit sind zu verwenden, rehydrieren Embryonen in PBST durch Waschen in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST für jeweils 10 Minuten. Schließlich waschen 2 mal für jeweils 10 Minuten in 100% PBST. Der genaue Zeitablauf ist nicht für PBST / Methanol wäscht wichtig
- Bleach Embryonen in einer 10% igen Wasserstoffperoxid-Lösung in PBST, wenn nötig, dunkle Pigmente zu entfernen. Embryonen sollten in Wasserstoffperoxid-Lösung für 10-20 Minuten inkubieren, je nach Alter des Embryos, und die Kappe der Mikrozentrifugenröhrchen sollte offen bleiben, um zu verhindern den Aufbau von Luftdruck
- Digest Embryonen mit 50 mg / mL Proteinase K 1:5000 verdünnt in PBST für 3-15 Minuten, je nach dem Alter des Embryos
- Re-fix Embryonen in 4% PFA für 30 Minuten, und dann 3 x waschen in PBST für jeweils 5 Minuten
Teil II: Die Hybridisierung der Ribosonden
(Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung für die Hybridisierung, 1,5 Stunden am nächsten Tag an Teil III)
- Prehybridize Embryonen mit Prähybridisierungslösung (PHS) in eine vorgewärmte 70 ° C Wasserbad für 2-3 Stunden
- Entfernen PHS, 0,5 mL Hybridisierungslösung und 1,5 ul zuvor synthetisierten Digoxigenin markierte Ribosonden, bei 70 ° C über Nacht inkubieren. Die Temperatur kann innerhalb von ein paar Grad in Abhängigkeit von der Ribosonde Ziel schwanken
- Am nächsten Tag waschen Embryonen bei 70 ° C in abgestuften Lösungen von 75%, 50% und 25% PHS in 2X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für jeweils 10 Minuten, dann in 0,2 X SSC waschen und 30 Minuten bei 68 ° C
- Wash in Maleinsäure-Puffer (MAB) 2 mal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur
Teil III: Anti-Digoxigenin (α-DIG) Antikörper Inkubation
(Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung zu blockieren, zu 2,5 Stunden am nächsten Tag zum Teil IV)
- -Embryonen zu einem 12-Well-Platte
- Pre-Block Embryonen in 1-2 ml Blocking-Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur
- Gleichzeitig pre-Block der Antikörper hergestellt, indem ein zweiter Band der Blockierungslösung und Verdünnen der anti-Digoxigenin-Antikörper 1:2000 in dieser Lösung
- Entfernen Sie vor Block und fügen 1-2 ml pre-blocked α-DIG-Lösung über Nacht inkubieren bei 4 ° C
- Am nächsten Tag waschen Embryonen in MAB. Lassen Sie die Embryonen in MAB für 5 Minuten Uraufführung inkubieren, dann führen Puffer Änderungen und inkubieren für zwei 10 Minuten, eine 30 Minuten und einem 60 Minuten Intervall. Der genaue Zeitablauf ist nicht notwendig
- Wash Embryonen 3 mal für jeweils 5 Minuten in alkalische Phosphatase (AP)-Puffer
Teil IV: Die Färbung und Endbearbeitung
(Zeitaufwand: 1 Stunde oder über Nacht zur Färbung, je nach Ribosonde verwendet wird, kann 4 Stunden, um von Glycerin wäscht, 6-10 Stunden pro Waschglycerinphase, beginnend in Glycerin aufbewahrt werden)
- Fügen Sie 1-2 mL Färbelösung, die Embryonen, wickeln Sie die Platte in Folie, und überprüfen Färbung in regelmäßigen Abständen (ca. alle 20 Minuten) bis zur Färbung reicht
- Wash Embryonen mit PBST 2 Mal für jeweils 5 Minuten, um die Farbreaktion zu stoppen
- Entwässern Embryonen mit 10 Minuten wäscht in 25% (1 Mal) und 50% (2 mal) Methanol in PBST, dann in 100% Methanol, um die Hintergrundfärbung zu entfernen
- Lassen Embryonen in 100% Methanol für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren
- Rehydrieren in PBST mit 10 Minuten wäscht in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST, dann in 100% waschen PBST 2 Mal
- Transfer gebeizt embryos um eine 80% ige Glycerin-Lösung in PBST mit einer abgestuften Reihe von Waschungen und lagern bei 4 ° C.
Rezepte:
- LB-Agar-Platten-10 g LB-Agar + 250 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, wenn kühl an add 250 ul Ampicillin, pour 15-20 ml warme Lösung in jede Petrischale, damit Agar zur Verfestigung
- LB-Medium-12.5 g LB Broth + 200 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, erlauben, bevor Sie mit kaltem
- 1% TAE-Gel-0.4 g Agarose, 40 ml 1X TAE, 2 ul Ethidiumbromid; Last 7 ul Plasmid (Plasmid Transformation von Target cDNA) oder 3 ul Ribosonde und 4 ul DEPC Wasser (In-situ-DIG-markierten RNA-Sonde Synthesis) + 1 ul loading Farbstoff, 5 ul DNA-Leiter
- Prähybridisierungslösung-50% Formamid, 5x SSC, 9,2 mm Zitronensäure, 1% Tween-20
- Hybridisierungslösung-Prähybridisierungslösung plus 500 ug / ml tRNA und 50 pg / mL Heparin
- MAB-100mm Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH auf 7,5
- Blocking Solution-3 Teile MAB, 1 Teil 10% Boehringer Blockierungsreagenz in MAB, 1 Teil Wärme Lamm Serum deaktiviert
- AP-Puffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20
- Färbelösung-5-Bromo-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) und Nitro-Tetrazolium (NBT) in AP-Puffer
4. Repräsentative Ergebnisse
Wenn richtig ausgeführt, wird die Reaktion zwischen dem NBT, BCIP und alkalische Phosphatase bilden einen violetten Niederschlag, der auf der Zebrafisch-Embryos als violetter Fleck erscheinen soll. Ribosonden sollte vorher aus cDNA entsprechend dem Gen von Interesse synthetisiert werden. Daher kann gefolgert werden jeden Fleck sichtbar repräsentiert Bereichen der Zebrafisch, in denen das Gen von Interesse an diesem speziellen Entwicklungsphase wurde transkribiert werden. Fgf8a (Reifers et al, 1998;;. Abbildung 2); deltaC (Oates et al, 2005.) Für die Zwecke dieses Kurses wurden Ribosonden aus aldh1a2 (; Begemann et al, 2001;. Abbildung 1 zuvor raldh2) synthetisiert; MyoD1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Abbildung 3) und myl7 (bisher cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Die Färbung wurde in der Mittellinie und in anatomischen Strukturen einschließlich der Somiten, tailbud, Myotom, Gehirn und Herz zu erwarten. Ace/fgf8a Mutanten erwartet wurde, Mängel in viele dieser Strukturen haben. Die Färbung war einfach visualisiert mit Hilfe eines Standard-Binokular. Weitere Quellen enthalten weitere Informationen und Fehlersuche an WISH Techniken ähnlich denen hier beschriebene (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009).
Abbildung 1. Ein Zebrafisch-Embryos 24 Stunden nach der Befruchtung, die mit Ribosonden spezifisch für aldh1a2 wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in den Augen, Hinterhirn, Brustflosse Knospe Primordien und Somiten zu sehen. Anterior ist oben, ist hinten auf den Boden.
Abbildung 2. Ein Zebrafisch-Embryos in den 13 Somiten Stadium der Entwicklung, die mit einer Sonde spezifisch für fgf8a wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung in der Telencephalon, dorsalen Zwischenhirn, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Somiten und tailbud gesehen. Ventral ist auf der linken Seite, ist dorsal nach rechts.
Abbildung 3. A 22 Stunden nach der Befruchtung Zebrafischembryo, die mit einem Ribosonde spezifisch für pax2a, einem robusten Marker nützlich für die Visualisierung des Nervensystems wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in der Aderhaut Fissur, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Ohr-Vesikel und Rückenmarksneuronen gesehen werden. Dorsalansicht mit anterior der linken Seite.
Discussion
Wunsch wurde in einer vergleichenden Wirbeltiere Biology Laboratory natürlich verwendet werden, um die Schüler verstehen die Rolle der Genetik in der anatomischen Entwicklung durch die Visualisierung von bekannten Genexpressionsmuster. Für den ersten Teil des Kurses, durchgeführt Studenten Sezieren von Organismen aus verschiedenen chordate Taxa, so dass sie genügend Zeit, um zu studieren, zu verstehen, Vergleichen und Gegenüberstellen Wirbeltiere Anatomie.
Als Einführung in den zweiten Teil des Kurses wurden die Schüler eine formelle Vortrag beschreibt Zebrabärblingentwicklung und Anatomie gegeben. Die Methoden und die erwarteten Ergebnisse des Wunsches Experiment wurden ebenfalls diskutiert. Die Schüler wurden dann leben Zebrafisch auf Somitogenese und prim-6 Stufen der Entwicklung gegeben, und bei 2 und 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter dem Binokular untersucht. Das war es, den Studierenden ein besseres Verständnis von dem, was Zebrafischembryonen aussehen und welche Arten von morphologischen Veränderungen, die über Ontogenese auftreten.
In den nächsten Labor Sitzung wurden die SchülerInnen Zebrafischembryonen in die WISH zuvor hatte ausgeführt gegeben. Sie wurden gebeten, zu studieren und beschreiben die Genexpressionsmuster für jedes Gen von Interesse (Ribosonde verwendet). Embryonen für WISH wurden aus Paarungen zwischen den Mitgliedern einer heterozygoten ace/fgf8a Linie abgeleitet. Basierend auf Mendelschen Vererbung, waren 25% der Embryonen aus der ace/fgf8a Paarungen erwartet, um homozygote Mutanten zu sein und Mängel in vielen der anatomischen Strukturen auf die in diesem Kurs konzentriert aufweisen. Basierend auf den veröffentlichten Berichten und unveröffentlichte Beobachtungen in der Albertson Labor wurden Defekte im Gehirn und unsachgemäße Herzen looping erwartet, aber auch Mängel in den Somiten (Brand et al, 1996;. Albertson und Yelick, 2005; persönliche Beobachtungen).
Die Schüler wurden gebeten, alle Proben, Wildtyp (heterozygote Tiere sind nicht von Wildtyp-Geschwister in frühen Stadien der Entwicklung) und homozygote Mutanten zu untersuchen, für jeden Genexpressionsmuster vorgestellt. Sie wurden dann gebeten, Laborberichte beschreiben ihre Ergebnisse zu schreiben, und auf der Grundlage ihrer Kenntnisse der Anatomie und Genetik, wie defekte Gen-Expression kann anatomische Fehlbildungen gefällt haben.
Die Schüler schienen diese Laborübung mit Spannung und Neugier zu erhalten. Die meisten hatten noch nie verwendet WISH vor und waren sehr in diesem Teil des Kurses interessiert. Die Schüler fanden die unterschiedlichen Muster der Genexpression in der Zebrafisch-Embryos faszinierend, visualisiert einige sogar beschrieb die Färbungsmuster indem man sie mit bekannten Designs und Symbole, wie ein Smiley-Gesicht. Die daraus resultierende Laborberichte zeigten die Schüler hatten ein allgemeines Verständnis für den Wunsch-Protokoll und die Expression von Genen in bestimmten anatomischen Strukturen. Die Studierenden wurden auch erforderlich, um die spezifischen Funktionen der Gene zu verstehen studierte mit WISH während des Labor (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Es war offensichtlich, aber dass bestimmte Teilnehmer beschränkt Hintergrundwissen über die Signalwege und Gene von Interesse war. Weitere Informationen zu diesen Konzepten in dem Wunsch Einführungsvortrag kann eine willkommene Ergänzung für die Verwendung von WISH in Zukunft Comparative Biology Vertebrate Kurse.
Da das Protokoll dauert in der Regel vier aufeinander folgenden Tagen, je nach dem Zeitplan des Kurses können die Schüler nur in der Lage sein, einen Teil des Experiments in der Klasse und der Lehrer muss für den Rest abgeschlossen. In unserem Comparative Biology Wirbeltiere Klasse abgeschlossen Studenten die Färbung Reaktionen im Labor, während die Teaching Assistant durchgeführt alle vorangegangenen Schritte. Wenn es bevorzugt ist, den Schülern durchführen wollen in der Klasse haben, kann das Protokoll in Untereinheiten, die über mehrere Sitzungen Labor durchgeführt werden, können je nach den zeitlichen Rahmen für die Klasse geteilt werden. Wenn es nicht machbar ist für Studenten das gesamte Protokoll durchführen, um, wie es hier war aufgrund der Labor-Sitzung nur einmal in der Woche können die Schüler die Färbelösung zu Beginn der Klasse hinzu, und, je nach Ribosonde verwendet werden, haben die Färbung komplett innerhalb einer Stunde. Die Zeit, die für den Fleck zu entwickeln variiert stark mit jedem Ribosonde und eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen und sollten vor der Klasse vorgegeben werden. Bemerkenswert ist, wenn die Schüler nur dann entwickeln Sie den Fleck in Labor, wird Trainer ist verantwortlich für alle vorhergehenden Schritte, die viel Zeit und Aufwand außerhalb des Klassenzimmers erfordert. Falls gewünscht, könnte eine kürzere Alternative zu wünschen Immunhistochemie mit Antikörper Etiketten Proteinlokalisierung visualisieren, aber in dieser Zeit, sind Zebrafisch-spezifische Antikörper für Entwicklungsbiologie Gene nicht ohne weiteres verfügbar. Eine weitere Möglichkeit wäre, WISH auf verschiedenen Wirbeltierarten durchführennd haben die Schüler vergleichen die Expressionsmuster der gleichen Gene in verschiedenen Organismen (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Schwellenländer Modellorganismen, 2008; Schwellenländer Modellorganismen, 2010).
Das übergeordnete Ziel der Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Kurses war es, die Studierenden, wie molekularbiologische Techniken verwendet, um anatomische Entwicklung Studie zu demonstrieren. Es bot auch Gelegenheit für Studenten, wie veränderte Genexpression kann nicht nur zu Missbildungen, sondern auch auf evolutionären Wandel führen zu spekulieren. Formalisiert als evolutionäre Entwicklungsbiologie (oft als "Evo-Devo" genannt), soll mit diesem schnell wachsenden Bereich der Studie zur Genotyp und Phänotyp durch die Entwicklung zu verknüpfen und potenzielle mechanistischen Grundlagen der evolutionären Wandel zu erläutern. Mit dem Aufstieg der auf diesem Gebiet sind mehr Ökologen, organismal Biologen und Physiologen Einsatz molekularbiologischer Techniken in ihre Forschung. Wir behaupten, dass die Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich wird dazu beitragen, den Lehrplan halten, um mit der derzeitigen technologischen und konzeptionellen Fortschritte in der Forschung bisher und eine bessere horizontale Ausrichtung der oberen Ebene der Biologie Kurse durch die Kombination von biologischen Teilfelder zu erleichtern. Darüber hinaus wird diese integrative Ansatz bieten den Studierenden die Möglichkeit, eine Auswahl an biologischen Forschung Techniken in einem Kurs lernen, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten an das Department of Biology an der Syracuse University und Dr. Marilyn Kerr anerkennen für ihre Rollen in der Verwaltung des Comparative Biology Wirbeltiere natürlich. Die Albertson Labor ist durch Zuschüsse R21DE019223 von den National Institutes of Health / National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung sowie zu gewähren R01AG031922 von den National Institutes of Health / National Institute on Aging unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Isopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | |
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Biolabs | varies | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher Scientific | s608500 | |
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Group | 11277073910 | |
| T3 RNA Polymerase | Roche Group | 1031163 | |
| T7 RNA Polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA Polymerase | Roche Group | 810274 | |
| Protector Rnase Inhibitor | Roche Group | 3335399001 | |
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche Group | 4716728001 | |
| EDTA molecular biology reagent | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Lithium Chloride 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher Scientific | o4042500 | |
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Methanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinase K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamide 1 L | Fisher Scientific | F841 | |
| 20x SSC 1 L | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Maleic acid R 500 g | Fisher Scientific | o3417500 | |
| Sodium Chloride 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Anti DIG AP fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher Scientific | m33500 | |
| BCIP 3 ml | Roche Group | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Roche Group | 11383213001 | |
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR international | 62406-165 | |
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | |
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | |
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" x 250 ft | Fisher Scientific | s37441 | |
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Aluminum Foil | Grocery Store | ||
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References
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