Summary
전체 마운트
Abstract
현장 하이브리드화의 전체 마운트 (소원) 전체 마운트 표본 내의 특정 mRNA의 성적의 지방화를 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 분자 생물학 연구소에서 일반적인 기법입니다. 이 기술은 (알버스톤와 Yelick, 2005 적응) 시러큐스 대학에서 상위 수준의 학부 비교 척추의 생물학 실험실 교실에서 사용되었습니다. 비교 척추의 생물 실험실 코스의 처음 두 3가 학생들에게 주로 전통적인 해부와 모델의 사용을 통해 다양한 chordate의 taxa를 대표하는 여러 생물의 발생학 및 총 해부학을 공부하는 기회를 주었다. 코스의 마지막 부분 소원이 zebrafish 배아에서 수행어진 분자 기법을 고용 척추 개발의 관찰을 통해 해부학을 가르치고하는 혁신적인 접근 방식을 참여. heterozygous fibroblast의 성장 인자 8 (fgf8a) 돌연변이 라인, 에이스가 사용되었습니다. Mendelian 상속으로 인해, 에이스 제작 야생 유형, heterozygous 및 1시 2분 1초 비율 homozygous ace/fgf8a의 돌연변이를 intercrosses. 정중선과 같은 심장, somites, tailbud, myotome, 그리고 두뇌와 같은 해부 학적 구조를 개발 알려진 표현식 패턴과 RNA 프로브가 사용되었습니다. 원하는데로 학생들이 수업 시간에 얼룩 반응을 수행과 함께, 13 체절과 프림 - 6 단계에서 zebrafish를 사용하여 수행되었습니다. 개발의 다른 단계에 zebrafish 배아의 연구는 학생들에게 이러한 해부 학적 구조 ontogeny 이상의 변화 모습을 관찰하는 능력을했다. 또한, 일부 ace/fgf8a의 돌연변이가 부적 절한 심장 반복하고, 체절과 두뇌 개발에 결함이 표시됩니다. 이 실험실에있는 학생들은 모두 외부 해부학뿐만 아니라 유전자 발현 패턴을 사용하여 여러 장기 시스템의 정상적인 발전을 관찰했다. 그들은 또한 부적 절한 해부 개발과 유전자 발현을 (즉, putative 돌연변이) 표시 배아를 파악하고 설명했다.
이미 필요한 장비를 소유하지 기관이나 연구소 및 curricular 혁신을위한 자금이 부족한 지도자 들어, 시약 및 장치의 금융 비용으로 시간과 노력이 부분에 필요한 것입니다 고려하는 요소 수 관계 설정의 강사. 그럼에도 불구하고, 우리는 교실 실험실 설정이 유형의 소망의 사용이 발달 유전 해부학 사이의 중요한 연결을 제공할 수 있다고 주장. 기술 진보와 분자 수준에서 organismal 개발을 연구하는 능력보다 쉽게, 저렴하고, 점점 인기가되면서, 많은 진화 생물학, 생태학, 그리고 physiologists는 분자 생물학 분야의 연구 전략에 의존하고 있습니다. 비교 척추의 생물학 연구실 교실에서 사용하면 좋겠 분자와 해부학 하나의 코스 내에 수렴하는 방법의 한 예입니다. 이것은 상위 수준의 대학 학생들에게보다 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 현대 생물 학적 연구 기법을 연습할 수있는 기회를 제공합니다.
Protocol
1. cDNA 플라스미드 대상의 변환
부품 I : 플라스미드의 변환
(소요 시간 : 3 시간 플러스 하룻밤 배양)
- 42 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 SOC 영양소 국물 (반응 당 500 μL)
- 얼음 유능한 세포를 해동
- 25 μL 관할 세포에 플라스미드 1 μL 추가
- 20 분 동안 얼음 플레이스
- 45 초 동안 42 ° C의 물을 욕조에 열 충격 세포
- 바로 이분을 위해 얼음에 세포를 장소
- 세포의 각 유리병 42 ° C 영양 국물 500 μL 추가
- ° C 분당 255 회전에서 2 시간 동안 (RPM) 37시 쉐이크
- Luria Bertani (LB) 한천 플레이트 접시에 75 μL 변환 믹스
- 부화 플레이트 37 ° C에서 거꾸로 하룻밤
부 II : E. 콜리 문화
(소요 시간 : 15 분 플러스 하룻밤 배양)
- 문화 튜브에 각각 반응 나누어지는 3 ML의 LB의 국물과 50 MG / ML 암피실린 3 μL를위한
- 한천 플레이트에서 1 박테리아 콜로니을 다쳤고, 각 문화 튜브에 추가
- 37 문화 튜브를 흔들어 ° C를 255 RPM 하룻밤에
파트 III : 플라스미드 준비
(소요 시간 : 1.5 시간)
- 5 프라임 FastPlasmid 미니 키트 (카탈로그 # 2300000)를 사용하여 야간 문화 플라스미드 분리
- 준비 플라스미드의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드 물들일 1 % 트리스 - 아세테이트 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (태) 겔의 키트에서 eluted DNA를 실행
2. 원위치 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서
부품 I : 플라스미드의 선형화
(소요 시간 : 2.5 시간)
- 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 :
플라스미드 준비 20 ML 제한 효소 * 2 ML 버퍼 ** 10 ML 소 혈청 알부민 10X (BSA) 10 ML 디에틸 Pyrocarbonate (DEPC) 물 58 ML 100 ML - 37 ° C 2 시간 동안 부화
* 플라스미드에 따라 다릅니다
** 제한 효소에 따라 다릅니다
부 II : 전사
(소요 시간 : 3 시간)
- 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 :
플라스미드 선형 4 ML 10X 전송 버퍼 ** 4 ML Digoxigenin 라벨 믹스 4 ML 효소의 * 2 ML RNase 억제제 2 ML DEPC 워터 24 ML 40 ML - 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다
- 효소의 * 2 μL 추가
- 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다
- DNase 2 μL 추가
- 37 품어 ° C를 20 분
* 플라스미드에 따라 다릅니다
** 효소와 다름
파트 III : 강수
(소요 시간 : 하룻밤 사이에 부화 1 시간 5 분 플러스 2 시간 원심 분리기하고 다시 정지)
- 0.2M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 μL 추가
- 4M 염화 리튬의 5 μL 추가
- 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μL 추가
- 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화
- 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기
- 7분에 대한 건조 펠릿
- 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지
- 37 품어 ° C를 5 분
파트 IV : 분별화은 - 프로브 크기가 0.6 킬로바이트보다 큰 경우에만 수행
(소요 시간 : 대개, 프로브의 크기에 따라 20여 분 다름 없음)
- 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 :
RNA 프로브 20 ML DEPC 워터 12 ML 중탄산 4 ML 나트륨 탄산염 4 ML 40 ML - 60 ° C의 물을 욕조에 품어. 방정식에서 배양 시간을베이스 :
시간 (min.) = (KB 시작 - 킬로바이트을 원하는가) / (KB X를 시작 0.11 x는 킬로바이트를 원하는)
평균 원하는 크기 = 0.6 킬로바이트
파트 V : 최종 강수량
(소요 시간 : 5 분하룻밤 부화, 1 시간 백인 군대가 플러스 2 시간)을 원심 분리기 및 겔 전기 영동을 다시 중단 1 시간
- 40 μL DEPC 물을 추가
- 8 μL 아세트산 나트륨을 추가
- 1.04 μL 빙초산 추가
- 240 μL 얼음 차가운 100 % 에탄올 추가
- 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화
- 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기
- 7분에 대한 건조 펠릿
- 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지
- 섞어 소용돌이
- riboprobe의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드와 1 %의 태 젤 자국에 다시 정지 솔루션을 실행
3. 원위치 하이브리드화에서 전체 마운트
부품 I : 태아의 고정 및 Proteinase K의 소화
(소요 시간 : 수정 하룻밤 플러스 4시간 저장 다음날, 2.5 시간 창고에서 파트 II까지)
- zebrafish 배아를 개최 수집하고 4 박 4 % paraformaldehyde (PFA)에서 해결 ° C
- 인산염에서 수정 배아를 씻어은 10 분마다 트윈 - 20 (PBSt) 3 회 0.1 %를 포함하는 호수 버퍼
- 세부적으로 밀고 집게를 사용하여 실험 시약 수동 dechorionate 배아 (필요한 경우)에 태아의 노출을 보장하기 위해
- 한 시간 만이라도 각 세척을 25 % 등급 일련의 세탁과 PBSt의 50 % 메탄올에 의해 배아를 탈수 후 -20 ° C에서 100 % 메탄올에 저장
- 때 사용할 준비가 50 % (2 회) 25 % (1 회) 10 분마다 PBSt의 메탄올로 세척하여 PBSt에서 배아를 rehydrate. 마지막으로 100 % PBSt 10 분만에 각 2 번 씻는다. 정확한 타이밍 PBSt / 메탄올 세척을위한 중요하지 않다
- 어두운 안료를 제거하는 PBSt에 10 % 과산화수소 용액, 필요한 경우에 블리치 배아. 배아는 배아의 연령에 따라 약 10-20 분 과산화수소 용액에 부화해야하며, microfuge 튜브의 뚜껑이 공기 압력의 빌드 - 업 방지하기 위해 열린 남아
- 50 MG / ML Proteinase K와 다이제스트 배아가 배아의 연령에 따라, 3-15 분 동안 PBSt에서 1:5000 희석
- 다음 다시 수정의 30 분 4퍼센트 PFA의 배아, 그리고 5 분 각각에 대해 PBSt 3 번 씻어
부 II : Riboprobes의 하이브리드화
(소요 시간 : 3 시간 플러스 하이브 리다이 제이션을위한 야간, 1.5 시간 파트 III에 다음날)
- 2~3시간에 대한 preheated 70 ° C 물 목욕에 prehybridization 솔루션 (PHS)와 배아를 Prehybridize
- , PHS를 제거 70 ° C 하룻밤에 품어 0.5 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션과 1.5 μL 이전 합성 Digoxigenin 표시된 riboprobes를 추가합니다. 온도 riboprobe 대상에 따라 몇도 이내에 수시로 바뀔 수 있습니다
- 그 다음날, 70 배아를 씻어 ° C 십분 각 2X 살린 - 나트륨 구연 산염 (SSC)의 PHS 75 % 50 %, 25 %의 등급 솔루션 후 68시 30 분 0.2X SSC의 세척 ° C
- 상온 10 분 각 Maleic 산성 버퍼 (MAB) 2 회 세척
파트 III : 안티 Digoxigenin (α - 발굴) 항체 인큐베이션
(소요 시간 : 3 시간 더하기 차단하는 숙박, 2.5 시간 파트 IV에 다음날)
- 12 잘 접시에 배아를 전송
- 상온에서 최소 3 시간 동안 1-2 ML 차단 솔루션에 사전 차단 배아
- 동시에,이 솔루션에서 차단 솔루션의 두 번째 볼륨을 준비하고 안티 - digoxigenin 항체를 1:2000 diluting하여 항체를 사전 차단
- 사전 블록을 제거하고 1-2 ML 사전 차단 α - 발굴 솔루션을 추가, 4 밤새 품어 ° C
- 그 다음날, MAB에서 배아를 씻으십시오. 배아 처음 5 분 MAB에 부화 허용, 다음 버퍼 변경을 수행하는 두 십분 한 삼십분 한 60분 간격에 대한 부화. 정확한 타이밍이 필요하지 않습니다
- 오분 알카라인 인산 가수 분해 효소 (AP) 버퍼에 각 태아에게 3 회 와시
파트 IV : 스테 이닝 및 최종 처리
(소요 시간 : 얼룩을 위해 하루 1 시간 사용 riboprobe에 따라 글리세롤의 세척, 글리세롤 세척 당 6-10시간의 시작 4 시간은 글리세롤에 저장되어있을 수 있습니다)
- 얼룩이 충분 때까지 배아에 1-2 ML의 얼룩 솔루션을 추가 호일로 접시를 포장하고, 정기적으로 (매 20 분)에 염색법 확인
- 얼룩 반응을 중지 5 분마다 PBSt 2 회와 배아 와시
- 배경 얼룩을 제거하는, 100 % 메탄올에 다음 25%에서 십분 세척 (1 시간) 50 % (2 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 배아를 탈수
- 배아는 상온에서 최소 2 시간 동안 100 %의 메탄올에 부화 허용
- 50 % 십분 세척 (2 회) 25 % (1 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 PBSt에 Rehydrate 다음 백퍼센트에 PBSt 2 번 씻어
- 스테인드 E를 전송4 등급 세척 일련의, 그리고 저장을 사용하여 PBSt에 80 % 글리세롤 솔루션 mbryos, ° C.
요리법 :
- LB 한천 플레이트 - 10g의 LB 한천 + 250 ML 증류수, 압력솥이 때 시원한 각 배양 접시에 15-20 ML 따뜻한 솔루션을 부어, 250 μL 암피실린를 추가, 한천이 응고 수
- LB의 국물 - 12.5 g의 LB 스프 + 200 ML 증류수, 압력솥은 사용하기 전에 냉각 허용
- 1% 태 젤 - 0.4 g 아가로 오스, 40 ML 1X 태, 2 μL ethidium의 브로마이드, 부하 7 μL 플라스미드 (cDNA 대상의 플라스미드 변환) 또는 3 μL riboprobe 4 μL DEPC 물 (현장 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서) + 1 μL 로딩 염료, 5 μL DNA 사다리
- Prehybridization 솔루션 50 % 포름 아미드, 배 SSC, 9.2mM 구연산, 1 % 트윈 - 20
- 하이브 리다이 제이션 솔루션 prehybridization 솔루션 플러스 500 μg / ML tRNA 50 μg / ML의 헤파린
- MAB - 100mM Maleic 산성, 150mM NaCl, 0.2M NaOH, 0.1 % 트윈 - 20, 7.5 산도
- MAB에 차단 솔루션 - 3 부품 MAB, 1 일부 10% Boehringer 차단 시약 1 일부 열 양고기 혈청을 비활성화
- 9.5에 AP 버퍼 60mM 트리스 - HCL의 산도, 60mM NaCl, 30mM MgCl 2, 0.1 % 트윈 - 20
- 얼룩 솔루션 - 5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 인산염 (BCIP) 및 니트로 파란색 tetrazolium (NBT) AP 버퍼
4. 대표 결과
제대로 수행되면, NBT, BCIP, 그리고 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 반응은 자주색 얼룩으로 zebrafish 배아에 나타납니다 보라색 침전물을 형성합니다. Riboprobes는 이전에 다음 ID로 관심의 유전자에 해당하는 cDNA의 합성해야합니다. 따라서, 그것은 어떤 얼룩 시각 관심의 유전자가 특정 발달 단계에서 베꼈는데되어있는 zebrafish의 영역을 나타냅니다 체결하실 수 있습니다. fgf8a (Reifers 외, 1998,,. 그림 2) deltaC (오츠 외, 2005).이 과정의 목적을 위해 riboprobes는 aldh1a2 (; Begemann 외, 2001;. 그림 1 이전 raldh2)에서 합성되었다; myod1 (와인버그 외, 1996.) shha (. 크라우스 외, 1993), pax2a (브랜드 외, 1996;. 그림 3)과 myl7 (이전 cmlc2;. Yelon 외, 1999) cDNA. 얼룩은 정중선과 somites, tailbud, myotome, 뇌, 심장을 포함한 해부 학적 구조를 예상했다. Ace/fgf8a의 돌연변이가 이러한 구조의 많은 결함을 가지고 것으로 예상했다. 얼룩이 쉽게 표준 해부 현미경을 사용하여 시각되었습니다. (Schoenwolf 2009.; D' 코스타 외, 2009;, Schmoldt 외, 2009. 클락, 2003) 추가 소스는 여기에 설명된 것과 유사한 기법을 기원에 대한 자세한 내용 및 문제 해결을 포함합니다.
aldh1a2 특정 riboprobes와 hybridized되어 그림 1. zebrafish 배아 24 시간 게시물 수정. 구체적인 얼룩은 눈, hindbrain, 가슴 지느러미 봉오리 primordia 및 somites에서 볼 수 있습니다. 앞쪽에이 최고입니다, 후부는 바닥입니다.
그림 2. fgf8a위한 프로브 특정 함께 hybridized되었습니다 발전 13 체절 단계에서 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 telencephalon, 지느러미 diencephalon, midbrain - hindbrain 경계, somites 및 tailbud에서 본 것입니다. 복부의 왼쪽이며, 지느러미는 올바른 것입니다.
그림 3. pax2a, 신경 시스템을 시각화하는 데 유용 강력한 마커에 대한 riboprobe의 특정과 hybridized되었습니다 22 시간 게시물 수정의 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 맥락막의 균열 (fissure), midbrain - hindbrain 경계, 귀의 소포 및 척수에있는 뉴런에서 볼 수 있습니다. 왼쪽 앞쪽에와 도설 볼 수 있습니다.
Discussion
원하는데로 학생 알려진 유전자 발현 패턴의 시각화를 통해 해부 개발 유전자의 역할을 이해하는 데 도움을 비교 척추의 생물학 실험실 과정에 사용되었다. 과정의 첫번째 부분을 위해, 학생들은 그들이 충분한 시간이, 공부 이해 비교 및 대비 척추의 해부학 수 있도록 여러 가지 chordate의 taxa를 대표하는 생물체에 대한 해부를 수행했습니다.
과정의 두 번째 부분에 대한 소개로, 학생들은 zebrafish 개발과 해부학을 설명하는 공식적인 강의를 제공했다. 기원 실험의 방법과 예상 결과도 논의되었습니다. 학생들은 다음 somitogenesis과 발전의 프림 - 6 단계에서 라이브 zebrafish을 받았고, 2 5 일 포스트 수정 (DPF)의 해부 현미경으로 검사합니다. 이것은 학생들에게 zebrafish 배아는 생김새의 더 나은 이해와 ontogeny 이상 발생하는 형태학의 변경 사항의 유형을 제공하는 것이었다.
다음 실험실 세션에서, 학생들은 좋겠는 이전에 다음 ID로 수행했다하는 zebrafish 배아를 부여했다. 그들은 관심의 각 유전자 (riboprobe 사용)에 대한 유전자 발현 패턴을 연구하고 설명하도록 요청했다. 좋겠어에 사용되는 배아는 heterozygous ace/fgf8a 라인의 구성원 사이에 matings에서 파생되었습니다. Mendelian 상속에 따르면, ace/fgf8a의 matings에서 배아의 25 %가 homozygous 돌연변이로이 과정에서 집중 해부 구조의 많은 결함을 전시 것으로 예상했다. 알버스톤 실험실에 게시된 보고서 및되지 않은 관찰 결과에 따르면, 뇌 및 부적 절한 심장 루핑의 결함뿐만 아니라 somites 결함 (.; 알버스톤과 Yelick, 2005; 개인 관측 브랜드 외, 1996)으로 예상했다.
학생들은 제시 각 유전자 발현 패턴에 대한 모든 표본, 야생 종류 (heterozygous 동물이 개발의 초기 단계에서 야생 타입 형제로부터 구별할 수 있습니다) 및 homozygous 돌연변이를 조사하도록 요청했다. 그들은 그들의 결과를 설명하는 실험실 보고서를 작성하도록 요청하고, 결함이있는 유전자 발현은 해부 학적 기형을 시켰던 수 있습니다 방법은 해부학과 유전학의 지식을 바탕으로했다.
학생들은 흥분과 호기심이 실험실 연습을받을 것 같았다. 대부분의 이전 좋겠 사용하지 못한 매우 과정의이 부분에 관심이 있었다. 학생들은 흥미로운 zebrafish 배아의 유전자 표현의 다양한 패턴을 발견, 일부도 설명 얼룩 패턴은 웃는 얼굴로 잘 알려진 디자인과 기호, 그들을 연결하여 시각. 그 결과 검사 결과는 학생들이 소원 프로토콜과 특정 해부 학적 구조 유전자의 표현에 대한 일반적인 이해를했다 보여주었다. . Huelsken 외, 2002,,. Geetha - Loganathan 외, 2008a;.. Geetha - Loganathan 외, 2008b 학생은 또한 유전자의 특정 기능을 이해하는 데 필요한하던 연구실 (스틱니 외, 2000 동안 소원을 사용하는 공부 ). 그것은 일부 학생들이 제한된 배경 신호 경로에 대한 지식과 관심의 유전자를했다, 그러나 분명했다. 이러한 개념에 대한 자세한 내용은 기초 강의 향후 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용에 오신 것을 환영합니다 외에도 수 있습니다 좋겠어.
프로토콜은 일반적으로 과정의 일정에 따라 연속 4 일 걸리므로, 학생은 수업 및 강사는 나머지에 대한 책임 있어야합니다에서 실험의 일부를 완료하실 수 있습니다. 교육 도우미는 모든 앞의 단계를 수행하는 동안 우리의 비교 척추 생물 수업에서 학생들은 실험실에서 얼룩 반응을 완료했습니다. 그것이 수행 수업 시간에 원하는 학생을 위해 선호하는 경우, 프로토콜은 클래스의 기간에 따라 여러 실험실 세션을 통해 수행할 수 있습니다 subunits로 나눌 수 있습니다. 여기 연구실 회의 한 번만 일주일에 의한되면서 학생들이 전체 프로토콜을 수행하는 것이 가능하지 않으면, 학생들이 사용 riboprobe에 따라 클래스의 시작 부분에 얼룩 솔루션을 추가할 수 있고, 얼룩이 완료했습니다 한 시간. 그것이 개발에 얼룩을 위해 소요되는 시간은 각 riboprobe 및 실험 조건의 다양한 크게 다르며, 그리고 수업 전에 정해진해야합니다. 특히, 학생은 실험실에있는 얼룩을 개발 될 경우, 교원은 교실 밖에서 상당한 시간과 노력을 요구할 것입니다 모든 이전 단계에 대해서는 책임을지지 않습니다. 원하는 경우, 소원을 짧은 대안은 그러나 현재로서는, 발달 유전자에 대한 zebrafish 특정 항체가 쉽게 사용할 수 없습니다, 단백질 지방화를 시각화하는 항체 레이블을 사용하여 immunohistochemistry 수 있습니다. 또 다른 옵션은 다른 척추 동물의 소원을 수행하는 것입니다ND는 학생들이 다른 생물에서 같은 유전자의 표현 패턴을 비교했습니다 (.; 아라 마키 외, 2007;. 이머징 모델 생물 2008; Pizard 외, 2004 신흥 모델 생물, 2010).
사용 overarching 목표는 비교 척추의 생물학 과정에서 분자 생물 학적 기법 해부 개발을 연구하는 데 사용되는 방법을 학생들에게 보여주는 좋겠어요. 또한 유전자 발현뿐만 아니라 발달 기형뿐만 아니라 진화의 변화가 발생할 수 있습니다 방법 변경에 대해서 추측 학생들을위한 기회를 제공했습니다. 진화 발달 생물학 (종종 "에보 (Evo) - devo"이라고 함)과 같은 공식, 연구의 빠르게 성장하는 분야는 개발을 통해 유전자형 및 표현형를 연결하고, 진화 변화의 잠재적인 기계론의 기지를 명료하게하다하는 것을 목표로하고있다. 이 분야의 상승으로 더 많은 생태학, organismal 생물학 및 physiologists들은 연구에 분자 기술을 채용하고 있습니다. 우리는 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용이 연구에 현재의 기술 및 개념적 발전과 날짜, 및 생물 학적 subfields를 결합하여 상위 수준의 생물학 과정의 더 나은 수평 정렬을 촉진하기 위해 교과 과정을 유지하는 데 도움이됩니다 주장하고있다. 또한,이 통합 방식은 좀 더 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 학생 한 과정에서 생물 학적 연구 기법의 구색를 배울 수있는 기회를 제공할 것입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 비교 척추의 생물학 과정의 관리에서 역할에 대한 시러큐스 대학교 박사 매릴린 커에서 생물학 학부를 인정하고 싶습니다. 알버스톤 연구실은 노화에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소에서 국립 치과와 Craniofacial 연구 보건 / 국립 연구소의 연구소뿐만 아니라 부여 R01AG031922에서 부여 R21DE019223에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Isopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | |
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Biolabs | varies | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher Scientific | s608500 | |
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Group | 11277073910 | |
| T3 RNA Polymerase | Roche Group | 1031163 | |
| T7 RNA Polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA Polymerase | Roche Group | 810274 | |
| Protector Rnase Inhibitor | Roche Group | 3335399001 | |
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche Group | 4716728001 | |
| EDTA molecular biology reagent | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Lithium Chloride 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher Scientific | o4042500 | |
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Methanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinase K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamide 1 L | Fisher Scientific | F841 | |
| 20x SSC 1 L | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Maleic acid R 500 g | Fisher Scientific | o3417500 | |
| Sodium Chloride 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Anti DIG AP fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher Scientific | m33500 | |
| BCIP 3 ml | Roche Group | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Roche Group | 11383213001 | |
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR international | 62406-165 | |
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | |
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | |
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" x 250 ft | Fisher Scientific | s37441 | |
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Aluminum Foil | Grocery Store | ||
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References
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
- Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
- Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
- Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
- Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
- D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
- Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
- Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
- Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
- Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
- Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).
