Summary

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

Published: March 31, 2011
doi:

Summary

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Abstract

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).

For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Protocol

1. البلازميد تحول الهدف [كدنا] الجزء الأول : التحول من البلازميد (الوقت المطلوب : 3 ساعات بالإضافة إلى حضانة بين عشية وضحاها) SOC المرق الحار المغذيات في حمام المياه رقم 42 C (500 ميكرولتر في رد فعل) ذوبان الجليد على الخلايا المختصة إضافة 1 ميكرولتر البلازميد على الخلايا المختصة 25 ميكرولتر مكان على الجليد لمدة 20 دقيقة خلايا الصدمة الحرارية في درجة حرارة 42 درجة مئوية حمام ماء لمدة 45 ثانية المكان على الفور الخلايا على الجليد لمدة 2 دقيقة إضافة 500 ميكرولتر من 42 درجة مئوية مرق المغذيات إلى كل قارورة من الخلايا هزة بلغت 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 255 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة) 75 لوحة مزيج التحول ميكرولتر Bertani على لوحات لوريا آجار (LB) لوحات احتضان مقلوب على 37 درجة مئوية خلال الليل الجزء الثاني : E. القولونية الثقافة (الوقت المطلوب : 15 دقيقة بالاضافة الى حضانة بين عشية وضحاها) لكل رد الفعل ، قسامة LB مل مرق 3 و 3 ميكرولتر من الأمبيسيلين ملغ / مل 50 في أنبوب الثقافة كشط 1 مستعمرة البكتيريا من لوحة آغار وإضافة إلى كل أنبوب الثقافة هزة أنابيب الثقافة في 37 في 255 دورة في الدقيقة درجة مئوية خلال الليل الجزء الثالث : الإعدادية البلازميد (الوقت المطلوب : 1.5 ساعة) عزل البلازميد من الثقافات بين عشية وضحاها باستخدام 5 رئيس مجموعة صغيرة FastPlasmid (كتالوج # 2300000) للتحقق من وجود البلازميد أعد تشغيل eluted الحمض النووي من عدة على هلام 1 ٪ تريس – خلات – EDTA (تاي) ملطخة بروميد إيثيديوم 2. DIG في الموقع المسمى التجميعي دقق RNA الجزء الأول : الخطية من البلازميد (الوقت المطلوب : 2.5 ساعة) في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع : أعد البلازميد 20 مل * تقييد أنزيم 2 مل ** العازلة 10 مل 10X الزلال المصل البقري (BSA) 10 مل إثيل Pyrocarbonate (DEPC) المياه 58 مل 100 مل احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة * يختلف مع البلازميد ** يختلف مع انزيم التقييد الجزء الثاني : النسخ (الوقت المطلوب : 3 ساعات) في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع : الخطي البلازميد 4 مل 10X النسخ الاحتياطي ** 4 مل Digoxigenin تسمية ميكس 4 مل * بوليميريز 2 مل ريبونوكلياز المانع 2 مل DEPC المياه 24 مل 40 مل في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إضافة 2 ميكرولتر من بوليميريز * في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إضافة 2 ميكرولتر من الدناز احتضان في 37 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية * يختلف مع البلازميد ** يختلف مع بوليميريز الجزء الثالث : الأمطار (الوقت المطلوب : 5 دقائق زائد ساعة 2 إلى الحضانة بين عشية وضحاها ، 1 ساعة لأجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق) إضافة 4 ميكرولتر من EDTA 0.2M إضافة 5 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم 4M إضافة 150 ميليلتر من الإيثانول الباردة الجليد 100 ٪ في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، بعيدا صب طاف بيليه جافة لمدة 7 دقائق في 20 ميكرولتر المياه DEPC إعادة تعليق ، احتضان في 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية الجزء الرابع : التقطير — إجراء التحقيق إلا إذا كان حجم أكبر من 0.6 كيلو بايت (الوقت المطلوب : يختلف بناء على حجم التحقيق ، لا عادة أكثر من 20 دقيقة) في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع : دقق RNA 20 مل DEPC المياه 12 مل بيكربونات الصوديوم 4 مل كربونات الصوديوم 4 مل 40 مل احتضان في حمام الماء 60 ° C. قاعدة فترة حضانة على المعادلة التالية : الوقت (مقدار) = (بدءا كيلوبايت — المطلوب كيلوبايت) / (0.11 س س المطلوب بدءا كيلو بايت) متوسط ​​الحجم المطلوب = 0.6 كيلوبايت الجزء الخامس : الأمطار النهائي (الوقت المطلوب : 5 دقائقutes زائد ساعة 2 إلى الحضانة بين عشية وضحاها ، 1 ساعة لأجهزة الطرد المركزي واعادة تعليق ، 1 ساعة الكهربائي للهلام) إضافة الماء DEPC 40 ميكرولتر إضافة خلات الصوديوم 8 ميكرولتر إضافة 1.04 ميكرولتر الجليدية حمض الخليك إضافة 240 الجليد الباردة ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، بعيدا صب طاف بيليه جافة لمدة 7 دقائق في 20 ميكرولتر المياه DEPC إعادة تعليق ، الدوامة لمزج للتحقق من وجود riboprobe ، تشغيل حل إعادة علقت على 1 ٪ هلام ملون تاي مع بروميد إيثيديوم 3. جبل بأكمله في الموقع التهجين الجزء الأول : التثبيت من الأجنة وبروتين الهضم K (الوقت المطلوب : إصلاح بين عشية وضحاها بالإضافة إلى 4 ساعات في اليوم التالي للتخزين ، و 2.5 ساعات من التخزين إلى الجزء الثاني) نظم جمع الأجنة الزرد والإصلاح في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية غسل الأجنة ثابتة في الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1 ٪ توين – 20 (PBSt) 3 مرات لمدة 10 دقيقة كل لضمان تعرض الأجنة للكواشف التجريبية والأجنة dechorionate يدويا (إذا لزم الأمر) باستخدام غرامة ذات الرؤوس ملقط يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة متدرجة من 25 ٪ والميثانول بنسبة 50 ٪ في PBSt لمدة ساعة كل الغسيل ، ثم تخزن في الميثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية عندما تصبح جاهزة للاستخدام ، ترطيب الأجنة في PBSt عن طريق الغسيل في 50 ٪ (2 مرة) و 25 ٪ (1 مرة) الميثانول في PBSt لمدة 10 دقيقة لكل منهما. أخيرا يغسل 2 مرات لمدة 10 دقيقة في كل PBSt 100 ٪. التوقيت الدقيق ليست مهمة لPBSt / الميثانول يغسل الأجنة في محلول التبييض بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 10 ٪ في PBSt ، إذا لزم الأمر ، لإزالة الصبغات الداكنة. وينبغي أن الأجنة في احتضان حل بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10-20 دقيقة ، اعتمادا على عمر الجنين ، وغطاء للأنبوب microfuge ينبغي أن يظل مفتوحا لمنع تراكم الضغط الجوي المخفف الأجنة هضم مع 50 ملغ / مل K بروتيناز 1:5000 في PBSt ل3-15 دقائق ، اعتمادا على عمر الجنين إعادة إصلاح الأجنة في PFA 4 ٪ لمدة 30 دقيقة ، ثم يغسل 3 مرات في PBSt لمدة 5 دقائق كل الجزء الثاني : من التهجين Riboprobes (الوقت المطلوب : زائد 3 ساعات بين عشية وضحاها لتهجين ، و 1.5 ساعة في اليوم التالي إلى الجزء الثالث) Prehybridize الأجنة مع الحل prehybridization (PHS) في 70 مسخن مياه حمام ° مئوية لمدة 2-3 ساعات إزالة PHS ، إضافة 0.5 مل من محلول التهجين و 1.5 توليفها من قبل Digoxigenin ميكرولتر riboprobes المسمى ، احتضان عند 70 درجة مئوية خلال الليل. درجة الحرارة يمكن أن تتقلب في غضون بضع درجات اعتمادا على الهدف riboprobe في اليوم التالي ، وغسل الأجنة عند 70 درجة مئوية في حلول متدرجة من 75 ٪ ، 50 ٪ ، و 25 ٪ في PHS 2X سيترات الصوديوم المالحة (SSC) لمدة 10 دقيقة لكل منهما ، ثم يغسل في SSC 0.2X لمدة 30 دقيقة في 68 ° C يغسل في مخزن حمض المالئيك (ماب) 2 مرات لمدة 10 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة الجزء الثالث : مكافحة Digoxigenin (α – DIG) الحضانة جسم (الوقت المطلوب : زائد 3 ساعات بين عشية وضحاها إلى كتلة ، و 2.5 ساعة في اليوم التالي إلى الجزء الرابع) نقل الأجنة إلى جانب لوحة 12 قبل كتلة الأجنة في حل مل 1-2 حظر ما لا يقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة في وقت واحد ، قبل كتلة الجسم المضاد من خلال إعداد المجلد الثاني من الحل الحجب وتمييع لمكافحة digoxigenin 1:2000 الأضداد في هذا الحل قبل إزالة كتلة وإضافة 1-2 مل قبل حظر α – DIG الحل ، بين عشية وضحاها في احتضان 4 درجات مئوية في اليوم التالي ، وغسل الأجنة في ماب. السماح للأجنة لاحتضان في ماب لمدة 5 دقائق الأولى ، ثم تنفيذ التغييرات العازلة واحتضان لمدة دقيقة 10 الاثنين ، 30 دقيقة واحدة واحدة الفاصل الزمني 60 دقيقة. التوقيت الدقيق ليست ضرورية غسل الأجنة 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من القلوية العازلة (ا ف ب) الفوسفاتيز الجزء الرابع : تلطيخ والتجهيز النهائي (الوقت المطلوب : 1 ساعة ليلة وضحاها لتلطيخ ، اعتمادا على riboprobe المستخدمة ، يمكن تخزين 4 ساعات لبداية يغسل الجلسرين ، 6-10 ساعة في غسل الجلسرين ، والجلسرين) إضافة 1-2 مل تلطيخ حل للأجنة ، والتفاف لوحة في احباط ، والتحقق من تلطيخ على فترات منتظمة (كل 20 دقيقة) حتى تلطيخ غير كافية غسل الأجنة مع أوقات PBSt 2 لمدة 5 دقائق لكل لوقف تفاعل تلطيخ يذوى أجنة باستخدام 10 دقيقة يغسل في 25 ٪ (1 مرة) ، و 50 ٪ (2 مرات) الميثانول في PBSt ، ثم في الميثانول بنسبة 100 ٪ ، لإزالة تلوين الخلفية السماح لاحتضان الأجنة في الميثانول بنسبة 100 ٪ على الأقل 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في ترطيب PBSt يغسل به 10 دقيقة في 50 ٪ (2 مرة) و 25 ٪ (1 مرة) الميثانول في PBSt ، ثم تغسل في 100 ٪ PBSt 2 مرات نقل البريد الملونmbryos إلى حل الجلسرين 80 ٪ في PBSt ، وذلك باستخدام سلسلة متدرجة من يغسل ، وتخزينها في 4 درجات مئوية. وصفات : لوحات – 10 أغار أغار LB LB ز + 250 مل من الماء المقطر ، الأوتوكلاف ، عندما تبرد إلى إضافة لمسة أمبيسلين 250 ميكرولتر ، صب 15-20 مل حل الدافئة في كل طبق بتري ، والسماح لترسيخ آغار حساء مرق – LB LB 12.5 غرام + 200 مل من الماء المقطر ، الأوتوكلاف ، والسماح لتبرد قبل الاستعمال 1 ٪ تاي هلام agarose 0.4 ز ، 40 مل 1X TAE ، 2 بروميد إيثيديوم ميكرولتر ؛ تحميل 7 ميكرولتر البلازميد (البلازميد تحول الهدف [كدنا]) أو 3 و 4 riboprobe ميكرولتر المياه DEPC ميكرولتر (في الموقع المسمى DIG التجميعي دقق RNA) + 1 صبغة تحميل ميكرولتر ، 5 ميكرولتر سلم DNA Prehybridization حل – 50 ٪ formamide ، SSC 5X ، 9.2mM حمض الليمون ، 1 ٪ توين – 20 التهجين الحلول prehybridization حل زائد 500 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال و 50 ميكروغرام / مل هيبارين MAB – 100mM حمض المالئيك ، 150mM كلوريد الصوديوم ، هيدروكسيد الصوديوم 0.2M ، 0.1 ٪ توين – 20 ، ودرجة الحموضة إلى 7.5 حجب الحل – 3 أجزاء MAB ، 1 جزء كاشف بورنغير 10 ٪ حظر في MAB ، 1 حرارة الجزء المعطل الضأن المصل AP – 60mM تريس العازلة ، إلى 9.5 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ، 60mM كلوريد الصوديوم ، 30mM MgCl 2 ، 0.1 ٪ توين – 20 تلطيخ الحل – 5 – برومو كلورو – 4 – – 3 – indolyl الفوسفات (BCIP) ونيترو الزرقاء tetrazolium (NBT) في AP العازلة 4. الممثل النتائج عندما يقوم بشكل صحيح ، فإن التفاعل بين NBT ، BCIP ، والفوسفاتيز القلوية تشكيل يعجل الأرجواني التي يجب أن تظهر على الجنين والزرد وصمة الأرجواني. وينبغي توليفها Riboprobes سابقا من [كدنا] المقابلة لهذا الجين من الفائدة. لذا ، يمكن الاستنتاج أن أي تصور يمثل وصمة عار مناطق الزرد التي تم نسخها الجين الاهتمام في هذه المرحلة التنموية التي وجه الخصوص. لأغراض هذه الدورة التدريبية ، تم توليفها من riboprobes aldh1a2 (raldh2 سابقا ؛ Begemann وآخرون ، 2001 ؛. الشكل 1) ؛ fgf8a (Reifers وآخرون ، 1998 ؛. الشكل 2) ؛ deltaC (أوتس وآخرون ، 2005) ؛ myod1 (واينبرغ وآخرون ، 1996) ؛ shha (كراوس وآخرون ، 1993) ، pax2a (الماركة وآخرون ، 1996 ؛. الشكل 3) وmyl7 (cmlc2 سابقا ؛. Yelon وآخرون ، 1999) [كدنا]. وكان من المتوقع تلطيخ في خط الوسط والهياكل التشريحية بما في ذلك somites ، tailbud ، myotome والدماغ والقلب. وكان من المتوقع أن يكون المسوخ Ace/fgf8a عيوب في كثير من هذه الهياكل. وكان من السهل تصور التلوين باستخدام مجهر تشريح القياسية. مصادر إضافية تحتوي على مزيد من المعلومات وحلول للمشاكل على رغبة تقنيات مشابهة لتلك الموصوفة هنا (كلارك ، 2003 ؛. دكوستا وآخرون ، 2009 ؛ Schmoldt وآخرون ، 2009 ؛. Schoenwolf ، 2009). الشكل 1. جنين الزرد آخر 24 ساعة الإخصاب ، والتي تم تهجينها مع riboprobes محددة لaldh1a2. ويمكن رؤية محددة في تلوين العينين والدماغ المؤخر ، الزعانف الصدرية primordia برعم ، وsomites. الأمامي هو أعلى ، هو الخلفية إلى الأسفل. الشكل 2. الزرد جنين في المرحلة 13 من الجسيدة التنمية التي تم تهجينها مع محددة لتحقيق fgf8a. وينظر الى تلطيخ محددة في telencephalon ، الدماغ البيني الظهرية ، الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر الحدود ، somites وtailbud. بطني وإلى اليسار ، والظهرية وإلى اليمين. الشكل 3. وآخر 22 ساعة التسميد الجنين الزرد التي تم تهجينها مع riboprobe محددة لpax2a ، علامة قوية مفيدة لتصور النظام العصبي. ويمكن رؤية محددة في تلطيخ شق المشيمية ، الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر الحدود ، الحويصلة الأذنية ، والخلايا العصبية في النخاع الشوكي. عرض مع الظهرية الأمامية إلى اليسار.

Discussion

WISH was used in a Comparative Vertebrate Biology laboratory course to help students understand the roles of genetics in anatomical development through the visualization of known gene expression patterns. For the first part of the course, students performed dissections on organisms representing several different chordate taxa, allowing them ample time to study, understand, compare, and contrast vertebrate anatomy.

As an introduction to the second part of the course, students were given a formal lecture describing zebrafish development and anatomy. The methods and expected results of the WISH experiment were also discussed. Students were then given live zebrafish at somitogenesis and prim-6 stages of development, and at 2 and 5 days post fertilization (dpf) to examine under the dissecting microscope. This was to give students a better understanding of what zebrafish embryos look like and the types of morphological changes that occur over ontogeny.

In the next laboratory session, students were given zebrafish embryos in which WISH had been previously performed. They were asked to study and describe the gene expression patterns for each gene of interest (riboprobe used). Embryos used for WISH were derived from matings between members of a heterozygous ace/fgf8a line. Based on Mendelian inheritance, 25% of the embryos from the ace/fgf8a matings were expected to be homozygous mutants and to exhibit defects in many of the anatomical structures focused on in this course. Based on published reports and unpublished observations in the Albertson lab, defects in the brain and improper heart looping were expected, as well as defects in the somites (Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; personal observations).

Students were asked to examine all specimens, wild type (heterozygous animals are indistinguishable from wild type siblings at early stages of development) and homozygous mutants, for each gene expression pattern presented. They were then asked to write lab reports describing their results, and based on their knowledge of anatomy and genetics, how defective gene expression may have precipitated anatomical malformations.

Students seemed to receive this laboratory exercise with excitement and curiosity. Most had never used WISH before and were extremely interested in this part of the course. Students found the different patterns of gene expression in the zebrafish embryos intriguing, some even described the staining patterns visualized by associating them with well-known designs and symbols, such as a smiley face. The resulting lab reports showed the students had a general understanding of the WISH protocol and the expression of genes in specific anatomical structures. Students were also required to understand the specific functions of the genes studied using WISH during the lab (Stickney et al., 2000; Huelsken et al., 2002; Geetha-Loganathan et al., 2008a; Geetha-Loganathan et al., 2008b). It was evident however, that certain students had limited background knowledge of the signaling pathways and genes of interest. More information about these concepts in the WISH introductory lecture may be a welcome addition to the use of WISH in future Comparative Vertebrate Biology courses.

Since the protocol generally takes four consecutive days, depending on the schedule of the course, students may only be able to complete a part of the experiment in class and the instructor must be responsible for the remainder. In our Comparative Vertebrate Biology class, students completed the staining reactions in the laboratory, while the Teaching Assistant performed all preceding steps. If it is preferred to have the students perform WISH in class, the protocol may be divided into subunits that can be performed over several laboratory sessions, depending on the time frame of the class. If it is not feasible for students to perform the entire protocol, as it was here due to the lab meeting only once a week, students can add the staining solution at the beginning of class and, depending on the riboprobe used, have the staining complete within an hour. The time it takes for the stain to develop varies greatly with each riboprobe and a variety of experimental conditions, and should be predetermined before class. Notably, if students will only be developing the stain in lab, instructors will be responsible for all preceding steps, which will require significant time and effort outside of the classroom. If desired, a shorter alternative to WISH could be immunohistochemistry, using antibody labels to visualize protein localization, however at this time, zebrafish-specific antibodies for developmental genes are not readily available. Another option would be to perform WISH on different vertebrate species and have the students compare the expression patterns of the same genes in different organisms (Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010).

The overarching goal of using WISH in a Comparative Vertebrate Biology course was to demonstrate to students how molecular biological techniques are used to study anatomical development. It also provided an opportunity for students to speculate as to how altered gene expression may lead not only to developmental malformations but also to evolutionary change. Formalized as evolutionary developmental biology (often referred to as “evo-devo”), this rapidly growing field of study aims to link genotype and phenotype through development, and to elucidate potential mechanistic bases of evolutionary change. With the rise of this field, more ecologists, organismal biologists, and physiologists are employing molecular techniques in their research. We contend that the use of WISH in a Comparative Vertebrate Biology course will help to keep the curriculum up to date with current technological and conceptual advances in research, and to facilitate a better horizontal alignment of upper level biology courses by combining biological subfields. Moreover, this integrative approach will provide students the opportunity to learn an assortment of biological research techniques in one course, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the Department of Biology at Syracuse University and Dr. Marilyn Kerr for their roles in the administration of the Comparative Vertebrate Biology course. The Albertson lab is supported by grant R21DE019223 from the National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research, as well as grant R01AG031922 from the National Institutes of Health/National Institute on Aging.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)   Fisher 2300000  
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium   Invitrogen C404003  
LB Agar   Fisher BP1425-500  
LB Broth   Fisher BP1426-500  
Ampicillin Sodium Salt   Fisher BP1760-5  
Isopropanol   Acros 42383-0010  
Petri Dish 100 x 20 mm non treated   Laboratory Products Sales 430591  
14 ml Culture Tube, Snap Top   Fisher 1495911B  
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA   New England Bio Labs varies  
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml   Sigma D5758-25mL  
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g   Fisher s608500  
Gal 200 proof Ethyl alcohol   Fisher 04-355-451  
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L   Fisher bp13321  
Agarose Low EEO 100 g   Fisher BP160-100  
Ethidium Bromide 10 ml   Sigma 45-E1510  
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose   Fisher BP655-1  
1 kb Full Scale DNA Ladder   Fisher BP2582200  
DIG RNA Labeling Mix   Roche 11277073910  
T3 RNA Polymerase   Roche 1031163  
T7 RNA Polymerase   Roche 10881767001  
SP6 RNA Polymerase   Roche 810274  
Protector Rnase Inhibitor   Roche 3335399001  
Dnase I, Rnase Free 10,000 units   Roche 4716728001  
EDTA molecular biology reagent   Sigma e5134-500G  
Lithium Chloride 100 g   Fisher L121100  
Sodium Carbonate 1 kg   Fisher BP357-1  
Sodium Bicarbonate, 500 g   Fisher BP328-500  
Acetic Acid glacial ACS 500 ml   Fisher a38500  
Paraformaldehyde R 500 g   Fisher o4042500  
PBS Phosphate Buffer Saline 10X   Fisher bp3991  
Tween 20 500 ml   Fisher bp337500  
Methanol 5 L   Fisher A4124  
Proteinase K 50 mg   Fisher bp170050  
Formamide 1 L   Fisher F841  
20x SSC 1 L   Fisher bp13251  
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g   Fisher a940500  
Ribonucleic acid transfer type V   Sigma r7876-2.5KU  
Heparin Sodium salt 50 mg   Fisher bp252450  
Maleic acid R 500 g   Fisher o3417500  
Sodium Chloride 500 g   Fisher s271500  
Sodium Hydroxide 500 g   Fisher s318500  
Blocking Reagent   Roche 11096176001  
Lamb Serum 500 ml   Invitrogen 16070096  
Anti DIG AP fragments   Roche 11093274910  
2M Tris Solution 500 ml   Fisher bp1759500  
Magnesium Chloride 500 g   Fisher m33500  
BCIP 3 ml   Roche 11383221001  
NBT 3 ml   Roche 11383213001  
Glycerol 99% 2.5 L   Fisher AC158920025  
Plate 12 well PS ST w/Lid   VWR 62406-165  
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs   Laboratory Products Sales L262861  
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs   Laboratory Products Sales L262890  
1.6 ml microfuge tube   Laboratory Products Sales L234401  
2 Parafilm 2″ x 250 ft   Fisher s37441  
Transfer Pipet 7 ml   USA Scientific 1020-2520  
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk   USA Scientific 1111-3000  
1-200 μl Pipet Tip, Bulk   USA Scientific 1111-0006  
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk   USA Scientific 1111-2021  
Aluminum Foil   Grocery Store    
  • Autoclave
  • Micro-centrifuge
  • 37°C incubator (with shaker)
  • 4°C micro-centrifuge
  • Water bath
  • Vortex
  • Gel electrophoresis apparatus
  • -20°C freezer
  • -80°C freezer
  • Rocker/shaker
  • 4°C refrigerator
  • Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)

References

  1. Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
  2. Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
  3. Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
  4. Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
  5. Clark, M. . In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).
  6. D’Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
  7. . . Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , (2008).
  8. . . Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).
  9. Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 .
  10. Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 .
  11. Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
  12. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  13. Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
  14. Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
  15. Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
  16. Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
  17. Schoenwolf, G. C. . Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , (2008).
  18. Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
  19. Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
  20. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).

Play Video

Cite This Article
Jacobs, N. L., Albertson, R. C., Wiles, J. R. Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology. J. Vis. Exp. (49), e2533, doi:10.3791/2533 (2011).

View Video