Summary
Whole mount
Abstract
Hele monteren in situ hybridisatie (WISH) is een veelgebruikte techniek in de moleculair-biologische laboratoria gebruikt om de genexpressie te bestuderen door de lokalisatie van specifieke mRNA transcripten binnen het gehele monteren exemplaar. Deze techniek (aangepast van Albertson en Yelick, 2005) werd gebruikt in een hoger niveau undergraduate Vergelijkende gewervelde Biology Laboratory klaslokaal op Syracuse University. De eerste twee derde van de gewervelde Vergelijkende Biologie practicum geeft studenten de mogelijkheid om de embryologie en anatomie van verschillende organismen die verschillende ongewervelde taxa in de eerste plaats via de traditionele dissecties en het gebruik van modellen te bestuderen. Het laatste deel van de cursus betrokken een innovatieve benadering van het onderwijs door middel van observatie anatomie van gewervelde ontwikkeling gebruik van moleculaire technieken, waarin WISH werd uitgevoerd op zebravis embryo's. Een heterozygoot fibroblast groei factor 8 een (fgf8a) mutant lijn, aas, werd gebruikt. Als gevolg van Mendeliaanse overerving, ace intercrosses geproduceerd wild type, heterozygote en homozygote ace/fgf8a mutanten in een verhouding 01:02:01. RNA probes met bekende uitdrukking patronen in de middellijn en de ontwikkeling van anatomische structuren, zoals het hart, de somieten, tailbud, myotoom, en de hersenen werden gebruikt. WISH werd uitgevoerd met behulp van zebravis bij de 13 somiet en prim-6 podia, met studenten het uitvoeren van de kleuring reactie in de klas. De studie van de zebravis embryo's in verschillende stadia van ontwikkeling gaf de studenten de mogelijkheid om te observeren hoe deze anatomische structuren veranderd ontogenie. Bovendien hebben sommige ace/fgf8a mutanten weergegeven oneigenlijk hart looping, en defecten in somiet en ontwikkeling van de hersenen. De studenten in dit lab observeerde de normale ontwikkeling van de verschillende orgaansystemen met behulp van zowel externe anatomie als genexpressie patronen. Zij hebben ook geïdentificeerd en beschreven embryo's tonen oneigenlijk anatomische ontwikkeling en gen-expressie (dat wil zeggen, vermeende mutanten).
Voor instructeurs bij instellingen die niet al in het bezit van de vereiste apparatuur en waar fondsen voor lab en vernieuwing van het curriculum beperkt zijn, kan de financiële kosten van de reagentia en apparaten een factor om te overwegen, evenals de tijd en de inspanning die nodig is van de kant van de instructeur, ongeacht de instelling. Toch, we beweren dat het gebruik van WISH in dit soort klaslokaal het laboratorium instelling kan een belangrijke schakel tussen ontwikkelings-genetica en anatomie te geven. Naarmate de technologie evolueert en de mogelijkheid om organismale ontwikkeling te bestuderen op moleculair niveau wordt makkelijker, goedkoper en steeds populairder, zijn veel evolutionair biologen, ecologen, fysiologen en wenden zich tot onderzoek strategieën op het gebied van de moleculaire biologie. Het gebruik van WISH in een vergelijkend gewervelde Biologie laboratorium klas is een voorbeeld van hoe moleculen en anatomie kunnen samenkomen binnen een cursus. Dit geeft bovenste niveau studenten de kans om moderne biologische onderzoekstechnieken, wat leidt tot een meer gediversifieerde onderwijs en de bevordering van de toekomstige interdisciplinair wetenschappelijk onderzoek de praktijk.
Protocol
1. Plasmide Transformatie van Target cDNA
Deel I: Transformatie van plasmide
(Duur: 3 uur plus een nacht incubatie)
- Warm SOC voedingsstof bouillon in een 42 ° C waterbad (500 pi per reactie)
- Dooi competente cellen op ijs
- Voeg 1 ui plasmide tot 25 uL competente cellen
- Plaats op ijs gedurende 20 minuten
- Heat shock cellen in 42 ° C waterbad gedurende 45 seconden
- Onmiddellijk plaats cellen op ijs gedurende 2 minuten
- Voeg 500 ul van 42 ° C voedingsstoffen bouillon aan elke flacon van cellen
- Schudden bij 37 ° C gedurende 2 uur bij 255 omwentelingen per minuut (rpm)
- Plaat 75 pi transformatie mix op Luria Bertani (LB) agar platen
- Incubeer de platen omgekeerd bij 37 ° C gedurende de nacht
Deel II: E. coli Cultuur
(Verplicht Tijd: 15 minuten plus een nacht incubatie)
- Voor elke reactie, aliquot 3 ml LB bouillon en 3 pi van 50 mg / ml ampicilline in een cultuur buis
- Schraap een bacterie kolonie van de agar plaat en toe te voegen aan elke cultuur buis
- Schud kweekbuizen bij 37 ° C bij 255 rpm 's nachts
Deel III: Plasmide-Prep
(Duur: 1,5 uur)
- Isoleer plasmide van girale culturen het gebruik van de 5-premier FastPlasmid Mini Kit (Catalog # 2300000)
- Om te controleren op de aanwezigheid van voorbereide plasmide, voert het DNA geëlueerd uit de kit op een 1% Tris-acetaat-EDTA (TAE) gel gekleurd met ethidiumbromide
2. In Situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthese
Deel I: Linearisatie van plasmide
(Verplicht Tijd: 2,5 uur)
- In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren:
Bereid Plasmide 20 ml Restrictie-enzym * 2 mL Buffer ** 10 ml 10X Bovine Serum Albumine (BSA) 10 ml Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Water 58 ml 100 ml - Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur
* Varieert met plasmide
** Varieert met restrictie-enzym
Deel II: Transcriptie
(Verplicht Tijd: 3 uur)
- In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren:
Lineaire plasmide 4 mL 10X Transcriptie Buffer ** 4 mL Digoxigenine Label Mix 4 mL Polymerase * 2 mL RNase Inhibitor 2 mL DEPC Water 24 ml 40 ml - Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur
- Voeg 2 ul van polymerase *
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur
- Voeg 2 ul van DNase
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten
* Varieert met plasmide
** Varieert met polymerase
Deel III: Neerslag
(Benodigde tijd: 5 minuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer)
- Voeg 4 ul van 0,2 M EDTA
- Voeg 5 ul van 4M lithiumchloride
- Voeg 150 ul van ijskoude 100% ethanol
- Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts
- Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant
- Droge pellet voor 7 minuten
- Re-schorten in 20 uL DEPC water
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten
Deel IV: Fractionation - alleen uitvoeren als probe grootte is groter dan 0,6 kb
(Duur: varieert op basis van probe grootte, meestal niet meer dan 20 minuten)
- In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren:
RNA Probe 20 ml DEPC Water 12 ml Natriumbicarbonaat 4 mL Natriumcarbonaat 4 mL 40 ml - Incubeer in een 60 ° C waterbad. Basis van de incubatietijd van de vergelijking:
Tijd (min.) = (vanaf kb - gewenste kb) / (0,11 x vanaf kb x gewenste kb)
Gemiddelde gewenste size = 0,6 kb
Deel V: Final Neerslag
(Benodigde tijd: 5 min.nuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer, 1 uur voor gelelektroforese)
- Voeg 40 ul DEPC water
- Voeg 8 ul Natriumacetaat
- Voeg 1,04 ul ijsazijn
- Voeg 240 ul ijskoude 100% ethanol
- Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts
- Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant
- Droge pellet voor 7 minuten
- Re-schorten in 20 uL DEPC water
- Vortex te mengen
- Om te controleren op de aanwezigheid van riboprobe, voer het opnieuw opgehangen oplossing op een 1% TAE gel gekleurd met ethidiumbromide
3. Hele berg in situ hybridisatie
Deel I: Fixatie van embryo's en Proteinase K Spijsvertering
(Tijd Vereist: Fix 's nachts plus vier uur de volgende dag voor de opslag, 2,5 uur van opslag naar deel II)
- Verzamel geënsceneerde zebravis embryo's en 's nachts vast te stellen in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C
- Was vast embryo's in fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20 (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk
- Om de blootstelling van de embryo's om de experimentele reagentia, handmatig dechorionate embryo's (indien nodig) met behulp van fijne punt pincet zorgen
- Uitdrogen embryo's door wassen in een gegradeerde serie van 25% en 50% methanol in PBST gedurende een uur elke wasbeurt, op te slaan in 100% methanol bij -20 ° C
- Wanneer klaar voor gebruik, hydrateren embryo's in PBST door wassen in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST gedurende 10 minuten elk. Tot slot was twee keer voor 10 minuten elk in 100% PBST. Exacte timing is niet belangrijk voor PBST / methanol wast
- Bleach embryo's in een 10% waterstofperoxide-oplossing in PBST, indien nodig, donkere pigmenten te verwijderen. Embryo's broeden in waterstofperoxide-oplossing voor 10-20 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo, en de dop van de microfugebuis moet open blijven voor-opbouw te voorkomen van de luchtdruk
- Digest embryo's met 50 mg / ml proteïnase K verdund 1:5000 in PBST voor 3-15 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo
- Re-fix embryo's in 4% PFA gedurende 30 minuten, en daarna wassen 3 keer in PBST gedurende 5 minuten per
Deel II: Hybridisatie van riboprobes
(Duur: 3 uur plus 's nachts voor hybridisatie, 1,5 uur de volgende dag naar deel III)
- Prehybridize embryo's met prehybridisatie oplossing (PHS) in een voorverwarmde 70 ° C waterbad gedurende 2-3 uur
- Verwijder de PHS, voeg 0,5 ml hybridisatie-oplossing en 1,5 pi eerder gesynthetiseerd digoxigenine gelabeld riboprobes, incuberen bij 70 ° C gedurende de nacht. De temperatuur kan schommelen binnen een paar graden, afhankelijk van de riboprobe doel
- De volgende dag, wassen embryo's bij 70 ° C in gegradeerde oplossingen van 75%, 50% en 25% PHS in 2X zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) voor 10 minuten elk, daarna wassen in 0,2 X SSC gedurende 30 minuten bij 68 ° C
- Was in maleïnezuur Buffer (MAB) 2 keer voor 10 minuten elk bij kamertemperatuur
Deel III: Anti-digoxigenine (α-DIG) antilichaam Incubatie
(Duur: 3 uur plus 's nachts te blokkeren, 2,5 uur de volgende dag naar deel IV)
- Transfer embryo's om een 12 wells plaat
- Pre-block embryo's in 1-2 mL oplossing voor het blokkeren van minimaal 3 uur bij kamertemperatuur
- Tegelijkertijd, pre-blok het antilichaam door het opstellen van een tweede deel van het blokkeren van oplossing en verdunnen van de anti-digoxigenine antilichaam 1:2000 in deze oplossing
- Verwijder de pre-block en voeg 1-2 ml pre-geblokkeerde α-DIG-oplossing, overnachting incuberen bij 4 ° C
- De volgende dag, wassen embryo's in MAB. Laat de embryo's in MAB incubeer gedurende 5 minuten, daarna voer een buffer verandert en incubeer gedurende 10 minuten twee, een 30 minuten en een 60 minuten interval. Exacte timing is niet nodig
- Was de embryo drie keer voor vijf minuten elk in alkalische fosfatase (AP) buffer
Deel IV: Beitsen en nabewerking
(Duur: 1 uur tot 's nachts voor vlekken, afhankelijk van de gebruikte riboprobe, kan vier uur tot het begin van glycerol wast, 6-10 uur per glycerol wassen, worden opgeslagen in glycerol)
- Voeg 1-2 ml kleuroplossing om de embryo's, wikkel de plaat in folie en controleer vlekken op regelmatige tijdstippen (ongeveer om de 20 minuten) tot kleuring is voldoende
- Was de embryo's met PBST 2 keer voor 5 minuten om de kleuring reactie te stoppen
- Uitdrogen embryo's met behulp van 10 minuten wast in 25% (1 keer) en 50% (2 keer) methanol in PBST, dan is in 100% methanol, op de achtergrond te verwijderen vlekken
- Laat embryo's in 100% methanol incubeer gedurende minstens 2 uur bij kamertemperatuur
- Hydrateren in PBST met behulp van 10 minuten wast in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST, daarna wassen in 100% PBST twee keer
- Overdracht gebrandschilderde embryos tot een 80% glycerol oplossing in PBST, met behulp van een getrapte reeks van wast, en bewaar bij 4 ° C.
Recepten:
- LB agar platen-10 g LB-agar + 250 ml gedestilleerd water, autoclaaf, bij koel aan toe te voegen 250 uL ampicilline, giet 15-20 ml warme oplossing in elke petrischaal, laat agar stollen
- LB bouillon-12,5 g LB bouillon + 200 ml gedestilleerd water, autoclaaf, laat afkoelen voor gebruik
- 1% TAE gel-0.4 g agarose, 40 ml 1x TAE, 2 pL ethidiumbromide; belasting zeven pi plasmide (Plasmide Transformatie van Target cDNA) of 3 pi riboprobe en 4 pi DEPC water (in situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthesis) + 1 ui laden kleurstof, 5 ul DNA-ladder
- Prehybridisatie oplossing-50% formamide, 5x SSC, 9.2mM citroenzuur, 1% Tween-20
- Hybridisatie-oplossing-prehybridisatie oplossing plus 500 ug / ml tRNA en 50 ug / ml heparine
- MAB-100mm maleïnezuur, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH tot 7,5
- Het blokkeren van Solution-3 delen MAB, 1 deel 10% Boehringer het blokkeren van reagens in MAB, een deel warmte gedeactiveerd lam serum
- AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20
- Kleuroplossing-5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat (BVIE) en Nitro blauw tetrazolium (NBT) in AP buffer
4. Representatieve resultaten
Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, zal de reactie tussen de NBT, BCIP, en alkalische fosfatase vormen een paarse neerslag die moet op de zebravis embryo verschijnen als een paarse vlek. Riboprobes moet eerder worden gesynthetiseerd uit cDNA dat correspondeert met het gen van belang. Daarom kan worden geconcludeerd enige smet gevisualiseerd vertegenwoordigt gebieden van de zebravis, waarin het gen van belang is getranscribeerd op die bepaalde ontwikkelingsfase. Voor de toepassing van deze cursus werden riboprobes gesynthetiseerd uit aldh1a2 (voorheen raldh2; Begemann et al., 2001;. Figuur 1); fgf8a (Reifers et al., 1998;. Figuur 2); deltaC (Oates et al., 2005.); myod1 (Weinberg et al., 1996.) shha (. Krauss et al., 1993), pax2a (Brand et al., 1996;. figuur 3) en myl7 (voorheen cmlc2;. Yelon et al., 1999) cDNA. Kleuring werd verwacht in de middellijn en in de anatomische structuren met inbegrip van de somieten, tailbud, myotoom, hersenen en het hart. Ace/fgf8a mutanten werd verwacht dat ze gebreken in veel van deze structuren. Kleuring werd makkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een standaard dissectiemicroscoop. Aanvullende bronnen bevatten meer informatie en het oplossen van problemen aan de wensen van technieken die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven (Clark, 2003;. D'Costa et al., 2009; Schmoldt et al., 2009;. Schoenwolf, 2009).
Figuur 1. Een zebravis embryo 24 uur na de bevruchting, die is gehybridiseerd met riboprobes specifiek voor aldh1a2. Specifieke kleuring is te zien in de ogen, achterhersenen, borstvin knop primordia, en somieten. Anterior is naar de top, posterior is naar de bodem.
Figuur 2. Een zebravis embryo bij de 13 somiet stadium van de ontwikkeling die is gehybridiseerd met een probe specifiek voor fgf8a. Specifieke kleuring is te zien in de telencephalon, dorsale diencephalon, middenhersenen-achterhersenen grens, somieten, en tailbud. Ventraal is naar links, dorsale is aan de rechterkant.
Figuur 3. A 22 uur na de bevruchting zebravis embryo dat is gehybridiseerd met een riboprobe specifiek voor pax2a, een robuuste marker nuttig voor het visualiseren van het zenuwstelsel. Specifieke kleuring kan worden gezien in het vaatvlies spleet, middenhersenen-achterhersenen grens, Otic blaasje, en het ruggenmerg neuronen. Dorsale bekijken met anterior aan de linkerkant.
Discussion
WISH werd gebruikt in een vergelijkend gewervelde Biologie practicum om studenten te helpen de rol van genetica in anatomische ontwikkeling te begrijpen door het visualiseren van bekende genexpressie patronen. Voor het eerste deel van de cursus, de studenten uitgevoerd dissecties op organismen die verschillende ongewervelde taxa, waardoor ze ruim de tijd om te studeren, te begrijpen, te vergelijken, en het contrast gewervelde anatomie.
Als inleiding op het tweede deel van de cursus, waren studenten krijgen een hoorcollege beschreven ontwikkeling van de zebravis en anatomie. De methoden en verwachte resultaten van de wens experiment werden ook besproken. Studenten werden dan gegeven levende zebravis op somitogenesis en prim-6 stadia van ontwikkeling, en op 2 en 5 dagen na de bevruchting (DPF) te onderzoeken onder de microscoop te ontleden. Dit was om de studenten een beter begrip van wat zebravis embryo's eruit zien en de aard van de morfologische veranderingen die zich voordoen over ontogenie.
In de volgende laboratorium sessie werden de studenten gegeven zebravis embryo's, waarin WISH eerder was uitgevoerd. Ze werden gevraagd te bestuderen en de genexpressie patronen te beschrijven voor elk gen van belang (riboprobe gebruikt). Embryo's die voor WISH waren afkomstig van kruisingen tussen leden van een heterozygote ace/fgf8a lijn. Op basis van Mendeliaanse overerving, werd 25% van de embryo's uit de ace/fgf8a paringen zal naar verwachting worden homozygote mutanten en defecten vertonen in veel van de anatomische structuren gericht op het in deze cursus. Gebaseerd op gepubliceerde rapporten en niet-gepubliceerde waarnemingen in de Albertson lab, werden gebreken in de hersenen en het oneigenlijke het hart looping verwacht, evenals gebreken aan de somieten (Brand et al., 1996;. Albertson en Yelick, 2005; persoonlijke observaties).
De studenten werd gevraagd om alle exemplaren, wild-type (heterozygote dieren zijn niet te onderscheiden van wild type broers en zussen in een vroeg stadium van ontwikkeling) en homozygote mutanten te onderzoeken, voor elk gen gepresenteerde expressie patroon. Zij werden vervolgens gevraagd naar het laboratorium van rapporten beschrijven hun resultaten schrijven en op basis van hun kennis van de anatomie en genetica, hoe defecte gen expressie kan anatomische afwijkingen hebben neergeslagen.
Studenten leek dit laboratorium te oefenen met spanning en nieuwsgierigheid te ontvangen. De meesten hadden nog nooit gebruikt WISH voor en waren zeer geïnteresseerd in dit deel van de cursus. Studenten de verschillende patronen van genexpressie te vinden in de zebravis embryo's intrigerende, sommigen zelfs beschreef de kleurpatronen gevisualiseerd door ze te associëren met bekende ontwerpen en symbolen, zoals een smiley gezicht. De resulterende lab rapporten bleek dat de studenten had een algemeen begrip van de wens protocol en de expressie van genen in specifieke anatomische structuren. Studenten werden ook verplicht om de specifieke functies van de genen te begrijpen bestudeerd met behulp van WISH tijdens het lab (Stickney et al., 2000;. Huelsken et al., 2002;. Geetha-Loganathan et al., 2008a;.. Geetha-Loganathan et al., 2008b ). Het was duidelijk echter dat bepaalde studenten beperkte achtergrond kennis van de signaalwegen en genen van interesse had. Meer informatie over deze concepten in het WISH inleidende lezing kan een welkome aanvulling op het gebruik van WISH in de toekomst Vergelijkende gewervelde Biologie cursussen.
Aangezien het protocol over het algemeen duurt vier opeenvolgende dagen, afhankelijk van het schema van de cursus kan de student slechts in staat zijn om een deel van het experiment in de klas en de instructeur moet verantwoordelijk zijn voor de rest af te ronden. In onze vergelijkende gewervelde biologie klas, studenten de vlekken reacties in het laboratorium, terwijl de student-assistent verricht alle voorgaande stappen. Als het de voorkeur van de Studenten voeren WISH in de klas hebben, kan het protocol worden verdeeld in onderafdelingen die kunnen worden uitgevoerd over meerdere laboratorium sessies, afhankelijk van het tijdsbestek van de klas. Als het niet haalbaar is voor studenten om de hele protocol uit te voeren, zoals het was hier te wijten aan het lab vergadering slechts een keer een week kunnen studenten de kleuroplossing toe te voegen aan het begin van de les en, afhankelijk van de gebruikte riboprobe, hebben de kleuring te voltooien binnen een uur. De tijd die het duurt voor de vlek te ontwikkelen varieert sterk met elkaar riboprobe en een verscheidenheid aan experimentele condities en moet vooraf worden bepaald voor de les. Met name indien studenten alleen zal de vlek in het lab te ontwikkelen, zal instructeurs verantwoordelijk zijn voor alle voorgaande stappen, wat veel tijd en moeite buiten het klaslokaal vereist. Indien gewenst, kan een korter alternatief WISH worden immunohistochemie, met behulp van antilichamen labels aan eiwit lokalisatie te visualiseren, maar op dit moment, zebravis-specifieke antilichamen voor ontwikkelingsstoornissen genen zijn niet direct beschikbaar. Een andere optie zou zijn om WISH uit te voeren op verschillende gewervelde diersoorten eennd hebben de studenten de expressiepatronen van dezelfde genen te vergelijken in verschillende organismen (Pizard et al., 2004;. Aramaki et al., 2007;. Emerging modelorganismen, 2008; Emerging modelorganismen, 2010).
Het overkoepelende doel van het gebruik van WISH in een vergelijkend gewervelde Biologie cursus was om de leerlingen laten zien hoe moleculaire biologische technieken worden gebruikt om de anatomische ontwikkeling te bestuderen. Het bood ook een mogelijkheid voor studenten om te speculeren over hoe veranderde genexpressie kan leiden niet alleen tot ontwikkeling misvormingen, maar ook voor evolutionaire verandering. Geformaliseerd als evolutionaire ontwikkelingsbiologie (vaak aangeduid als "evo-devo"), deze snel groeiende vakgebied is gericht op genotype en fenotype koppelen door middel van ontwikkeling, en om potentiële mechanistische basis van evolutionaire verandering te helderen. Met de opkomst van dit gebied zijn meer ecologen, organismale biologen en fysiologen gebruik moleculaire technieken in hun onderzoek. We betogen dat het gebruik van de wens van in een vergelijkend Vertebrate Biologie cursus zal helpen om het curriculum up-to-date met de huidige technologische en conceptuele vorderingen in het onderzoek, en een betere horizontale uitlijning van de bovenste niveau biologie cursussen te vergemakkelijken door het combineren van biological deelgebieden. Bovendien zal deze geïntegreerde benadering bieden studenten de mogelijkheid om een assortiment van biologisch onderzoek technieken te leren in een cursus, wat leidt tot een meer gediversifieerde onderwijs en de bevordering van de toekomstige interdisciplinair wetenschappelijk onderzoek.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag aan het Departement Biologie te erkennen van de Syracuse University en Dr Marilyn Kerr voor hun rol in het beheer van de gewervelde Vergelijkende Biologie cursus. De Albertson lab wordt ondersteund door subsidie R21DE019223 van de National Institutes of Health / National Institute of Dental en Craniofaciale Onderzoek, evenals verlenen R01AG031922 van de National Institutes of Health / National Institute on Aging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Isopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | |
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Biolabs | varies | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher Scientific | s608500 | |
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Group | 11277073910 | |
| T3 RNA Polymerase | Roche Group | 1031163 | |
| T7 RNA Polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA Polymerase | Roche Group | 810274 | |
| Protector Rnase Inhibitor | Roche Group | 3335399001 | |
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche Group | 4716728001 | |
| EDTA molecular biology reagent | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Lithium Chloride 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher Scientific | o4042500 | |
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Methanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinase K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamide 1 L | Fisher Scientific | F841 | |
| 20x SSC 1 L | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Maleic acid R 500 g | Fisher Scientific | o3417500 | |
| Sodium Chloride 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Anti DIG AP fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher Scientific | m33500 | |
| BCIP 3 ml | Roche Group | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Roche Group | 11383213001 | |
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR international | 62406-165 | |
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | |
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | |
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" x 250 ft | Fisher Scientific | s37441 | |
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Aluminum Foil | Grocery Store | ||
|
|||
References
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
- Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
- Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
- Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
- Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
- D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
- Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
- Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
- Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
- Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
- Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).
