Summary
Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
많은 전염성 질병의 바이러스 원인의 진단은 바이러스의 고유한 시퀀스 다양성뿐만 아니라 전통적인 방법에 의해 감지되지 SARS coronavirus 2009 유행성 H1N1 독감 바이러스로 소설 바이러스 병원균의 지속적인 출현으로 인해 어렵습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 이전에 개발하고 보존 순서 상동 1을 바탕으로 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설 변종을 감지할 수있는 능력과 Virochip라는 판 - 바이러스 microarray 플랫폼을 확인했습니다. Virochip를 사용하여, 우리는 동등하거나 기존의 임상 테스트를 2-5로 뛰어난 감도로 입원한 환자에 설명할 수없는 중요한 질병의 경우를 포함한 호흡기 감염,과 관련된 바이러스의 전체 스펙트럼을 확인했습니다. Virochip 또한 SARS coronavirus 6,7, 소설 리노 바이러스의 clade 5, XMRV (전립선암에 연결된 레트로 바이러스) 8, 조류 bornavirus (앵무새의 낭비 질병의 원인) 9 포함한 새로운 바이러스를 식별하는 데 사용되었습니다 호흡기 질환과 diarrheal 10 어린이와 소설 cardiovirus. Virochip의 현재 버전은 애질런트 microarray 플랫폼에 포팅 2009 년 12 월 현재 GenBank에 ~ 이상 1500 바이러스로부터 파생된 ~ 36,000 프로브로 구성되어있다. 여기 샘플 핵산 추출, 임의 primers를 사용하여 PCR 증폭, 형광 염료 정관 및 microarray의 하이브리드화, 검사 및 분석을 포함하여 (~ 24 시간 처리 시간) 처음부터 끝까지 Virochip 분석 처리에 관련된 단계를 보여줍니다.
Protocol
Virochip 분석의 단계는 임상 샘플에서 (1) 핵산 추출, 추출 RNA (2) 반대로 전사 및 2 차 - 가닥 cDNA 합성, 무작위로 준비하는 cDNA (3) PCR 증폭, (3) Cy3 형광 염료의 정관을 포함 , Virochip microarray로 표시된 자료 (4) 하이브 리다이 제이션, 그리고 (5) 검사 및 분석 (그림 1). 아래의 프로토콜은 독감과 같은 질병을 가진 아이에서 비강 면봉 샘플에 Virochip 분석의 사용을 보여줍니다.
프리머 시퀀스
프라이머 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - (N 9) -3 '
프라이머 B 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3 '
1. 핵산 추출
- 이 샘플은 잠재적으로 전염성이 있으므로 임상 시료에서 핵산 추출은 Biosafety 레벨 2 (BSL - 2) 이상의 조건 하에서 수행되어야합니다.
- 비강 면봉 샘플 바이러스성 지주 매체 수송이다. 1.5 ML Eppendorf의 microcentrifuge 관에 샘플 나누어지는 200 μL.
- 옵션 : 0.22 μm의 필터 (바이러스성 입자 정화)을 통과 샘플
- 선택 사항 : 제조 업체의 지침에 따라 터보 DNAse 키트 (앰비온)를 사용 DNAse (호스트 게놈 DNA를 저하하고 보호 encapsidated 바이러스 핵산에 대한 정화)와 pretreat 샘플
- Zymo ZR 바이러스성 RNA 추출 키트 또는 제조 업체의 지침에 따라 Qiagen Ultrasens 바이러스 키트를 사용하여 샘플을 추출합니다.
2. 역방향 전사 및 2 차 - 스트랜드 CDNA 합성 ( "라운드")
- RNA를 추출 4 UL 1 UL 40 μL / pmol 프리머을 추가합니다. 65 열 ° C thermocycler (예 : GeneAmp PCR 시스템 9700) 후 5 분 방 온도 X 5 분 식지.
- 2 μL 배 RT 버퍼, 1 μL 12.5 MM dNTP 1 μL 물, 0.5 μL 0.1M DTT, 0.5 μL 및 SSIII RT (Invitrogen)로 구성된 마스터 믹스 5 μL를 추가합니다. 42 품어 ° C X 60분.
- 프로그램 thermocycler에서 94에 열을 ° 10로 냉각 C X 2 분 (중지 리버스 transcriptase 반응), ° C, 펄스 원심 분리기, 다음 1 μL 배 Sequenase 버퍼, 3.8 μL 물로 구성된 5 μL Sequenase 믹스를 추가 그리고 0.15 μL Sequenase (USB 공사). 2 차 스트랜드 합성 들어, 10 ° 37 C ° C 8 분 이상, 94에 다음 8 분, 열을 보유 ° C X 2 분 (Sequenase를 inactivate)을 10 ° C (보유)에 냉각. 최대 램프
- 옵션 : 앳는 cDNA 샘플은 -20 ° C.에이 시점에서 저장할 수 있습니다
3. 의 PCR 증폭이 임의로 준비하는 CDNA ( "라운드 B")
- 5 μL 10X PCR 버퍼, 1 μL 12.5 MM dNTP 1 μL 100 pmol / μL 뇌관의 B, 1 μL KlenTaq LA (시그마), 37 μL 물로 구성된 마스터 믹스 45 μL에 드르 5 UL 샘플을 추가합니다.
- 다음과 같이 PCR 프로토콜을 실행 94 ° C, 2 분 → (94의 25주기 ° C, 30 S / 50 ° C, 45 S / 72 ° C, 1 분) → 72 ° C, 5 분 → 10 ° C ( 개최)
- 1.5 % 아가로 오스 전기 영동 젤에 드르 B 샘플을 확인하십시오. 약 200의 얼룩 - 1000 BP는 시각되어야합니다 (그림 2A)
4. Cy3 형광 염료의 설립
- 옵션 : 다른 샘플이 Cy5 형광 염색으로 표시하고 동일한 microarray에 hybridized 수 있습니다.
- AA - dNTP를 통합하기 위해, 5 UL 10X PCR 버퍼, 1 UL 12.5 MM AA - dNTP (Invitrogen), 1 UL 100 pmol / UL 뇌관 B, 1로 구성된 마스터 믹스 45 UL에 드르 B 샘플 5 UL을 추가 1 UL KlenTaq LA (시그마), 37 UL 물. PCR 프로토콜 다음과 같이 프로그램을 실행 : 94 ° C, 2 분 → (94의 15주기 ° C, 30 S / 50 ° C, 45 S / 72 ° C, 1 분) → 72 ° C, 5 분 → 10 ° C ( 개최)
- 제조 업체의 지침에 따라 DNA 청소 및 농축기 - 5 키트 (Zymo 연구)로 앳 C 예제를 청소합니다. 10 μL에 Elute.
- 1M 중탄산염 1 UL (시그마)와 앳 C 예제 1 UL Cy5 (GE 헬스케어)를 추가합니다.
- 어둠 속에 품어 X 1 시간.
- 제조 업체의 지침에 따라 DNA 청소 및 농축기 - 5 키트 (Zymo 연구)와 Cy3 - 라벨 샘플을 청소하십시오. 12 μL에 Elute.
5. Virochip Microarray에 하이브 리다이 제이션
- 옵션 : (샘플의 정상화를위한) Nanodrop 분광 광도계에 통합 cDNA 농도와 염료의 양을 확인 1.5 μL를 사용하여
- PCR 스트립 관에 25 μL의 총 볼륨 (애질런트) 1 μL 25X 조각 버퍼, 5 μL 배 차단 버퍼, Cy3 - 라벨 샘플의 9.5 μL (또는 정상화 금액) 및 물을 추가
- 2X GEx의 하이브리드화 버퍼 (애질런트) 25 μL를 추가합니다. 거품을 제거하기 위해 간략하게 스핀 다운.
- 가스켓 슬라이드에있는 예제 40 μL를로드합니다.
- 장소 애질런트 - 인쇄 Virochip 배열 (Californi 대학샌프란 시스코 / 애질런트) (아래 "애질런트"표시된 쪽) 개스킷 슬라이드 위에 단단히하고 나사를 고정.
- 65 밤새 잡종 ° C 오븐, 10 RPM 속도 설정.
- 37 ° C.에 배열, 앞서 열을 가하다 버퍼 2 (애질런트)를 씻어 버퍼 1 (애질런트)의 개스킷 슬라이드 / 배열 샌드위치 수중 갈라놓을. 버퍼 1 X 1 분 씻으십시오. preheated 버퍼 2 X 1 분에 씻으십시오. 천천히 (멀리 직접 배열의 적극적인 측면을 만지지 않도록주의하고 여분의 수분 윅에 kimwipe 사용) 거품을 피하기 위해주의하고, 버퍼 2 슬라이드를 제거
- 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입하고 배열 스캐너에 넣습니다.
6. Virochip 검색 및 분석
- 스캔 Cy3 - 표시된 배열 악기의 표준 스캔 프로토콜 (그림 2B)에 따라 5 μm의 또는 2 μm의에서.
- 육안 검사, 클러스터 분석, 또는 자동 Virochip 분석 프로그램에 의해 Virochip의 microarrays를 분석, 11 E - 예측했다. 이러한 세 가지 방법 중 각각으로 인플루엔자 바이러스가 쉽게 비강 면봉 샘플 (독감과 같은 질병을 가진 아이에서) (그림 2C)에 감지
7. 대표 결과 :
프로토콜이 제대로되면 얼룩이 드르 B 단계 (그림 2A) 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동에서 볼 수 있습니다. 애질런트 플랫폼에 Virochip microarray는 (그림 2B) 시각 분석하기 어려울 수 있지만, 바이러스가 존재한다면 그것은 쉽게 육안 검사, 클러스터 분석, 및 / 또는 E - 예측 (그림 1C)에 의해 식별되어야합니다. 검정에 대한 긍정적인 제어 역할을하는, 샘플은 알려진 바이러스 (박테리오 파지 MS2 예 : 담배 모자이크 바이러스)에서 핵산의 측정할 수량를 타서 수 있습니다.
그림 1. Virochip microarray 처리 및 분석의 개략도. 임상 시료에서 핵산을 추출은 무작위 증폭 형광 염료로 표시하고, Virochip microarray에 hybridized입니다. Microarrays 2 μm의 해상도에서 스캔 및 전자 예측을 포함하여, 전산 다양한 도구를 사용하여 분석하고 있습니다.
그림 2. Virochip 분석의 단계는 임의의 PCR, 200 얼룩에 의해 증폭 후 -. 1000 BP 겔 전기 영동에 의해 시각 수 (A) (B) 8 배열 / 유리 슬라이드의 세 Virochip의 microarrays 아웃은 작은 영역으로 표시됩니다. 고장 접속 오른쪽 하단 모서리에있는 삽입된 페이지에 한 microarray니다. (C) 자동 microarray 바이러스 분석을 사용하여 임상 샘플에서 독감 바이러스의 존재를 드러내 E를 예측했다. 높은 유사성 점수 (S = 0.55)은 이처럼 매우 중요한 예측하고, 제로에 가까운 P - 값에 해당합니다.
Discussion
여기에 설명한 Virochip 프로토콜은 복잡하고 세심한과 숙련된 연구 기술자가 필요합니다. 정확한 시약의 농도와 PCR, 라벨에 대한 조건과 하이브 리다이 제이션이 중요합니다. Virochip 프로토콜은 쉽게 같은 핵산 추출에 대한 TRIzol (Invitrogen)와 같은 조직 추출 방법의 사용에 의해 질병 조직의 분석을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다. 프로브를 추가하거나 원하는 스펙트럼 및 범위의 광범를 얻을 필요 삭제할 수 있습니다, 예를 들어 "- the - fly 방식에서"같은 박테리아 및 곰팡이 등 nonviral 타겟의 검출을위한 프로브가 설계 될 수 있으며 추가됩니다. 현재 개발중인 Virochip 분석의 일부 응용 프로그램은 임상 실험실, 확산 조사, 약물 및 백신의 순도 검사, 그리고 새로운 바이러스성 병원체 발견에 광범위한 스펙트럼 바이러스 진단을 포함합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 Virochip 프로토콜의 초기 개발 및 최적화에 대한 데이비드 왕, 아나톨리 Urisman, 에이미 키슬러, 카엘 피셔, 패트릭 당나라, 그리고 알렉산더 Greninger 감사드립니다. 이 작품은 NIH K08 부여와 애보트 디스커버리 수상 (CC)을하고 하워드 휴스 의학 연구소 (JLD)를 지원합니다.
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
